Билет №25. Прямые (реакция агглютинации, реакция преципитации) и непрямые (реакция пассивной гемагглютинации, РИФ

Прямые (реакция агглютинации, реакция преципитации) и непрямые (реакция пассивной гемагглютинации, РИФ, РИФП, РСК) серологические реакции. Определение антигенов возбудителей и антител к возбудителям. Правила серодиагностики инфекционных заболеваний. Понятие титра, диагностического титра, «серая зона», проагглютиционные зоны.

Серологические исследования — это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:

1. Реакция агглютинации.

2. Реакция преципитации.

3. Реакция нейтрализации.

4. Реакция с участием комплемента.

5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Реакция агглютинации

Реакции агглютинации — это простые реакции склеивания корпускулярных антигенов с помощью антител.

Различают:

— прямые реакции агглютинации, которые используют для выявления антител в сыворотке крови больного. Добавление взвеси убитых микробов к сыворотке больного вызывает образование хлопьевидного осадка (положительная реакция склеивания микробов антителами). Используется для определения брюшного тифа, паратифа и др.

— реакция пассивной, или непрямой гемагглютинации основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности антигенами, взаимодействие которых с соответствующими антителами сыворотки крови больных приводит к образованию фестончатого осадка. Используется для определения беременности, выявления повышенной чувствительности больных к лекарственным препаратам и гормонам;

— реакция торможения гемагглютинации основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать вирусы, которые в результате теряют свойство склеивать эритроциты. Используется для диагностики вирусных болезней;

— реакция коагглютинации — разновидность реакции агглютинации, в которой антигены возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой.

Реакции преципитации

Реакции преципитации — реакции, в которых происходит осаждение комплекса антиген-антитело. Антиген в данном случае должен быть растворимым. Осадок комплекса антиген-антитело называется преципитатом. Реакцию ставят путем наслоения раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антиген-антитело на границе этих растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Наибольшее распространение получила реакция преципитации в полужидком геле агара (двойная иммуно-иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.). Реакцию используют для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента.

Реакция нейтрализации

Реакция нейтрализации основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки или ткани. При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к комплексу антиген-антитело. Если комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая тем самым гемолиз (разрушение) эритроцитов (реакция радиального гемолиза). Применяется для диагностики инфекционных болезней, в частности, сифилиса.

Реакция с использованием меченых антител или антигенов

Реакция основана на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками, меченными флюорохромами, способны светиться в ультрафиолетовых лучах люминисцентного микроскопа (реакция иммунофлюоресценции).

В иммуноферментном анализе вместо флюорохромов иммунную сыворотку можно метить ферментом (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфотаза) цвет.

Радиоиммунологический метод — количественное определение антител или антигенов, меченых радионуклидами, с применением аналогичных антигенов или антител.

Методы применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов.

Выявление антител к возбудителю как метод диагностики ЗППП — заболеваний, передающихся половым путем

Выявление антител к возбудителю как метод диагностики ЗППП – заболеваний, передающихся половым путемВыявление антител к возбудителю, или серологические методы основаны на естественной иммунной реакции организма вырабатывать антитела (IgM, IgA, IgG) на инфекцию. Лаборанты научились определять возбудитель, определяя характер антител в нашем организме.

Таким образом, методы выявления антител — косвенные, непрямые методы. Они выявляют наличие не самой инфекции или ее ДНК. Они выявляют реакцию организма на инфекцию — антитела.

Материалом для исследования служит кровь.

Эти методы наиболее широко применяются в диагностике сифилиса и вирусов (вирусных инфекций) — герпеса половых органов, гепатита В и гепатита С, ВИЧ-инфекции, цитомегаловирусной инфекции.

Однако и у этих методов есть свои недостатки. Так, антитела в крови сохраняются значительное время даже после окончания лечения и тотального устранения бактериальной инфекции. Поэтому зачастую эти методы не используются для диагностики заболеваний, который вызываются бактериями (исключая сифилис), так как они не позволяют отличить перенесенную и текущую инфекцию.

К серологическим методам диагностики относятся реакция непрямой иммунофлюорисценции (РНИФ), реакция агглютинации (РГА, РПГА), реакция связывания комплимента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), обнаружение сопутствующих клеток.

Достоинства методов, направленных на выявление антител к возбудителю или антигенов возбудителя в том, что в спорных случаях они показывают врачу стадию заболевания и его динамику (идет ли пациент на поправку или воспалительный процесс, активность инфекции все еще сильны).

Недостатки этих методов в том, что «следы» присутствия инфекции в организме в виде антител или антигенов появятся не менее чем через 2 недели после заражения, а такие инфекции, как ВИЧ и гепатит обладают еще более длительными так называемыми серонегативными периодами.

Кроме того, малое количество инфекции в крови пациента не вызывает воспаления. Потому эта инфекция не вызывает и появления антигенов и антител в крови. В итоге анализ приходит отрицательный, тогда как бактерии в организме есть.

Еще одна проблема непрямых методов — «следы» бактерий не всегда специфичны (то есть свойственны только для «вредного» возбудителя: у этого «вредного» микроба может быть несколько безопасных братьев и сестер, которые провоцируют выработку одних и тех же антител и обладают очень похожими антигенами). Так, обнаруженные в крови антитела к хламидиям не обязательно связаны с патогенной Chlamidiatrachomatis, они могли образоваться при попадании в организм легочной формы хламидии Chlamidiapneumonia, которую если и лечат, то другими методами.

Серологическая диагностика инфекционных болезней - методы, определения, суть, правила

Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.

В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля, ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).

РА — определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА — более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА — основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ — реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH - способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА — используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА — используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА — лантанидныйиммунофлюоресцентный анализ — используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.

Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 3—5 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.

Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни, что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.