Выделение нативных белков из растительного материала и их очистка от низкомолекулярных соединений

Гомогенизация биологического материала и экстракция белков. Небольшое количество (~5 г) зеленого горошка промывают дистиллированной водой, обсушивают с помощью фильтровальной бумаги, взвешивают и затем растирают в фарфоровой ступке с 3 г окиси алюминия (Аl₂O₃), добавляя порциями по 10−15 мл 0,01 М трис -глицинового буферного раствора (рН 8,3) до консистенции густой сметаны, в течение 10 мин. После этого гомогенат периодически перемешивают на протяжении 30 мин при комнатной температуре. Затем гомогенат центрифугируют при 5000 мин^-1 в течение 10 мин. Супернатант сливают в колбу, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,01 М трис -глицинового буферного раствора, выдерживают 15 мин и центрифугируют при тех же параметрах. Оба супернатанта объединяют и измеряют полученный объем. Это экстракт легкорастворимых белков.

Для экстракции труднорастворимых белков осадок, полученный после второго центрифугирования, ресуспендируют в 10 мл 0,01 М трис -глицинового буферного раствора (рН 8,3), содержащего 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10⁻³ М дитиотреитола, выдерживают 15 мин и центрифугируют при 5000 мин^-1 в течение 10 мин. Процедуру повторяют еще раз. Супернатанты объединяют и измеряют полученный объем.

Высаливание белков. Экстракты легко- и труднорастворимых белков предварительно охлаждают в холодильнике. 5 мл белкового раствора смешивают с равным объемом насыщенного (100%-ного) раствора сульфата аммония, перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем к раствору маленькими порциями при перемешивании добавляют сухой, мелко растертый в ступке порошок сульфата аммония до 80%-ного насыщения (уравнение (3.12) или таблица в приложении), причем каждую последующую порцию вносят после растворения предыдущей. После растворения последней порции сульфата аммония смесь оставляют на 10 мин, после чего осадок белков отделяют центрифугированием при 12 000 мин^-1 в течение 20 мин. Супернатант замораживают. Осадок белков растворяют в 2−5 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10⁻³ М дитиотреитола.

Количество сульфата аммония в граммах, которое нужно добавить к 1 л раствора при 20°С, чтобы из раствора с насыщением S ₁ получить раствор с насыщением S ₂, рассчитывают по формуле

(3.12)

где СА – количество сульфата аммония (твердого), г; S ₂ – требуемая степень насыщения раствора, %; S ₁ – исходная степень насыщения раствора, %.

В данном случае принимают, что раствор сульфата аммония 100%-ного насыщения соответствует 4,05 М раствору.

Диализ белковых растворов. Белковые растворы, полученные на предыдущей стадии, переносят в целлофановые мешочки, которые завязывают и помещают в стакан с 1 л физиологического раствора таким образом, чтобы уровни жидкости в мешочках и стакане совпадали. Диализ проводят в холодильнике в течение суток. После этого диализованные белковые растворы замораживают.