Фракции. Методы выделения индивидуального белка из смеси белков с близкими физико-химическими свойствами основаны на различиях белков: по молекулярной массе (методы

Методы выделения индивидуального белка из смеси белков с близкими физико-химическими свойствами основаны на различиях белков: по молекулярной массе (методы ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и гель-фильтрации), заряду (ионообменная хроматография), степени адсорбции белков и их растворимости в соответствующем растворителе (адсорбционная хроматография), способности белков к специфическим взаимодействиям с аффинным лигандом (аффинная хроматография).

Ультрацентрифугирование. Ультрацентрифугирование – это высокоскоростное центрифугирование. Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в возрастающем центробежном поле. Частицы, имеющие разную плотность, форму или молекулярную массу, осаждаются с разной скоростью. Скорость седиментации частиц зависит от центробежного ускорения g.

Суспензию белков в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. Ультрацентрифугирование позволяет получить в центрифужных пробирках, вращающихся со скоростью до 85000 об/мин, центробежное ускорение 30 000-50 000 g. При этом скорость осаждения белков пропорциональна их молекулярной массе.

При выделении индивидуального белка оптимальным считают центрифугирование, при котором получают плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость (супернатант). Хорошо разделяются компоненты с сильно различающимися коэффициентами седиментации. Коэффициент седиментации – это скорость осаждения частиц и молекул при ультрацентрифугировании. Его измеряют в единицах Сведберга (S). Одна единица Сведберга равна 10^-13 с. Численное значение S зависит от молекулярной массы и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации рибосом прокариот составляет 70 S, а рибосом эукариот – 80 S.

Ультрацентрифуги снабжены холодильной установкой для предотвращения перегрева ротора вследствие трения его о воздух. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены. Уравновешенные пробирки следует располагать в роторе одна против другой.

Ультрафильтрация. Данный методоснован на разделении молекул в соответствии с их размерами и заключается в продавливании растворов белка через специальные мембраны с использованием давления газа. Поры в мембране таковы, что более мелкие молекулы белков проходят через нее, а молекулы большего размера удерживаются и концентрируются по отношению к исходному раствору. Диффузия небольших молекул через мембрану определяется разностью гидростатических давлений по обе стороны мембраны. Раствор диффундирующего через мембрану вещества называется ультрафильтратом.

По своей разделительной способности этот метод хуже, чем гель-фильтрация, так как он позволяет получить только две фракции – более крупные молекулы и более мелкие молекулы. Вместе с тем он дает возможность сконцентрировать раствор выделяемого белка.

Приборы для ультрафильтрации состоят из камеры, в которой создается положительное давление, и снабжены магнитными мешалками (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Устройство для ультрафильтрации

Хроматография (chromatos – цвет, grapho – пишу). Это метод разделения, а также качественного и количественного анализа смеси веществ, основанный на перемещении дискретной зоны вещества вдоль слоя сорбента (неподвижной фазы) в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. Хроматографический метод был открыт в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом.

Принцип метода. Образец смеси веществ вводят в слой неподвижной фазы, и вместе с потоком подвижной фазы (элюента) компоненты смеси перемещаются вдоль слоя сорбента. При контакте веществ с поверхностью неподвижной фазы каждый из компонентов смеси взаимодействует с ней и распределяется между подвижной и неподвижной фазами в соответствии со своими свойствами и свойствами обеих фаз.

В связи с тем, что подвижная фаза непрерывно движется, лишь часть каждого из компонентов разделяемой смеси успевает взаимодействовать с поверхностью неподвижной фазы. Остальное уносится потоком подвижной фазы и взаимодействует уже с новым участком сорбента. При этом устанавливается динамическое равновесие между веществом, адсорбированным неподвижной фазой и находящимся в подвижной фазе. Участки сорбента с адсорбированным веществом при дальнейшем движении подвижной фазы омываются чистой подвижной фазой, не содержащей анализируемого вещества. При этом равновесие нарушается, происходит десорбция вещества и перенос его подвижной фазой к новому участку сорбента. Следовательно, перенос компонентов смеси вдоль слоя сорбента осуществляется со скоростью, меньшей, чем скорость движения подвижной фазы. Молекулы разных компонентов смеси обладают различной степенью сродства к неподвижной фазе, поэтому компоненты передвигаются с разной скоростью, что при достаточной длине слоя сорбента приводит к полному разделению смеси веществ на индивидуальные компоненты.

Таким образом, в процессе хроматографирования многократно повторяется переход вещества из одной фазы в другую и обратно (сорбция-десорбция) и движение его вдоль слоя сорбента.

Высокую эффективность разделения многокомпонентных смесей веществ, обладающих близкими свойствами, обеспечивают многократное повторение элементарных актов фазовых переходов, большая поверхность раздела фаз и относительно небольшая толщина взаимодействующих слоев фаз.

Каждый компонент занимает некоторый слой (зону) неподвижной фазы. Скорость перемещения вещества и положение его зоны на слое сорбента в какой-либо момент времени определяются скоростью перемещения подвижной фазы и значением коэффициента распределения вещества между неподвижной и подвижной фазами. Коэффициент распределения (К) – это отношение количества вещества, находящегося в неподвижной фазе, к его количеству в подвижной фазе. Подвижную и неподвижную фазы для хроматографического разделения выбирают таким образом, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными.

Если коэффициент распределения вещества равен единице (К = 1), то оно распределится между подвижной и неподвижной фазами равномерно и его концентрация в обеих фазах будет одинакова. Если коэффициент распределения вещества стремится к нулю (К → 0), это означает, что вещество практически полностью находится в подвижной фазе. И наоборот, если К → ¥, это свидетельствует о том, что молекулы вещества практически полностью находятся в неподвижной фазе.

Теория тарелок. Хроматографируемое вещество проходит слой сорбента порциями, распределяясь между подвижной и неподвижной фазами на отдельных участках слоя сорбента – тарелках. При этом на каждой тарелке устанавливается равновесное распределение вещества. Новая порция подвижной фазы, подаваемая на первую тарелку, приводит к новому распределению вещества между двумя фазами, причем часть вещества с данной тарелки переносится на следующую. На этой тарелке также устанавливается равновесие, а часть вещества переносится на последующие тарелки. Вследствие этого с каждой новой порцией подвижной фазы концентрация вещества на первой тарелке падает, а на последующих возрастает.

В результате такого перемещения и перераспределения хроматографируемое вещество оказывается на нескольких тарелках, причем на средних его концентрация достигает максимума по сравнению с соседними тарелками. Чем больше число уравновешиваний, тем выше концентрация вещества в определенной части колонки. Число уравновешиваний, как правило, определяется так называемым числом теоретических тарелок (N). На одной хроматографической колонке при одинаковых экспериментальных условиях величина N должна быть одной и той же для любых веществ, и она не зависит от длины колонки.

Мерой распределения вещества в колонке является величина, называемая высотой, эквивалентной одной теоретической тарелке (ВЭТТ). ВЭТТ (H) представляет собой высоту слоя сорбента (L), необходимую для установления равновесного распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами. Она определяется отношением длины слоя сорбента в колонке к числу теоретических тарелок в ней (H = L / N).

Таким образом, число теоретических тарелок и ВЭТТ являются величинами, характеризующими эффективность хроматографической колонки, т. е. чем больше число теоретических тарелок и меньше ВЭТТ при заданной длине колонки, тем выше эффективность колонки.

Классификация методов хроматографии. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую и жидкостную хроматографию. В газовой хроматографии анализируемые вещества должны находиться в газо- или парообразном состоянии, а в жидкостной хроматографии анализируют твердые или жидкие вещества, растворяющиеся в подвижной фазе. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы (твердое, жидкое или смесь твердой и жидкой фаз) различают варианты газовой и жидкостной хроматографии: газоадсорбционная, газожидкостная, жидкостно-адсорбционная и жидкостно-жидкостная.

В зависимости от природы процесса, лежащего в основе разделения веществ, различают адсорбционную, ионообменную, аффинную и гель-хроматографию (гель-фильтрацию). В адсорбционной хроматографии элементарным актом является адсорбция, и разделение основано на различии в адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте. В ионообменной хроматографии элементарным актом является обратимый обмен между ионами анализируемых веществ и ионизированными группами сорбента-ионита, и разделение основано на различии в значениях суммарных зарядов веществ или степени ионного сродства веществ к сорбенту. Аффинная хроматография базируется на биоспецифическом взаимодействии веществ с аффинным лигандом. В методе гель-фильтрации разделение основано на различии в размере молекул и осуществляется путем их прохождения через гели с определенными размерами пор.

В зависимости от способа проведения хроматографического процесса различают тонкослойную (ТСХ), или хроматографию в тонком слое, колоночную и baсh-хроматографию (хроматографию в объеме). В тонкослойной хроматографии слой неподвижной фазы наносят на пластинку из стекла или пластика. В колоночной хроматографии неподвижную фазу помещают в стеклянную или металлическую колонку. Вариантом колоночной хроматографии является капиллярная хроматография, когда неподвижную фазу наносят на внутренние стенки капилляра. В baсh-хроматографии неподвижную фазу вносят в раствор смеси разделяемых компонентов.

В зависимости от способа элюирования различают восходящую, нисходящую и радиальную хроматографию (применяют в ТСХ). При восходящей хроматографии подвижная фаза поднимается снизу вверх, при нисходящей хроматографии она опускается сверху вниз. При радиальной хроматографии исходный образец наносят в виде пятна в середину горизонтально расположенной пластинки, подвижную фазу медленно вводят в центр образца и элюирование идет радиально от центра, т. е. компоненты образца перемещаются к краям пластинки в виде концентрических колец.

Способ элюирования веществ может быть простым и градиентным. При простом элюировании состав и концентрация подвижной фазы не меняются в ходе хроматографического процесса. Способ градиентного элюирования заключается в постепенном непрерывном изменении состава и концентрации подвижной фазы в сторону возрастания ее элюирующей способности. Возможно также градиентное изменение температуры проведения хроматографического процесса.

Градиентное элюирование, в свою очередь, может быть ступенчатым или непрерывным. При создании ступенчатого градиента пользуются серией элюирующих растворов, пропускаемых через колонку последовательно один за другим. При создании непрерывного градиента состав и концентрацию элюирующего раствора изменяют постепенно, по линейной или нелинейной зависимости этих параметров от объема протекающей жидкости.

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают аналитическую, препаративную и полупрепаративную хроматографию. Аналитическая хроматография предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемых смесей, а препаративная и полупрепаративная – для выделения индивидуальных веществ в лабораторных и промышленных условиях.

Гель-фильтрация (гель-хроматография). Представляет собой метод разделения веществ при помощи гелей, основанный на различиях в размере молекул. Гель-фильтрация является вариантом жидкостно-жидкостной хроматографии, когда и подвижной, и неподвижной фазами служат разные жидкости. Но в отличие от нее в гель-фильтрации подвижной и неподвижной фазами выступает одна и та же жидкость. При этом та часть жидкости, которая протекает вдоль слоя гранул геля, служит подвижной фазой, а другая часть той же жидкости, проникающая в поры гранул геля, - неподвижной фазой.

Гель-фильтрация осуществляется с помощью молекулярных сит – инертных гидратированных материалов, представляющих собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефадекса – бактериального полисахарида), агарозы (из некоторых морских водорослей), акриламидных гелей (акрилекс) или полиоксиэтилена (Toyopearl).

Сефадексы – это нитевидные молекулы полисахарида декстрана, сшитые через определенные промежутки поперечными связями и свернутые в гранулы. Благодаря этому декстран становится водонерастворимым, сохраняя свои гидрофильные свойства и способность к быстрому набуханию в водной среде. Степень сшивки молекул определяет размер пор.

Агарозные гели, приготавливаемые из агар-агара, используют для разделения крупных белков с молекулярной массой до нескольких миллионов Да. Гели на основе декстрана и агарозы стабильны в воде, солевых растворах и органических растворителях, а также в щелочных и слабокислых растворах.

Полиакриламидные гели (ПААГ) получают путем полимеризации акриламида и N,N¢-метилен- бис -акриламида. Они имеют сходные с сефадексом интервалы фракционирования белков. Основная проблема, связанная с использованием сефадекса и ПААГ, заключается в мягкости их гранул. Даже очень слабое давление и высокая скорость потока вызывают их деформацию. Этого недостатка лишены декстраны, содержащие дополнительные поперечные сшивки, образованные акриламидом (сефакрил).

Гель-фильтрацию проводят на колонках, заполненных гранулами набухшего геля. Неподвижная фаза представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул, - точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря адгезии с поверхностью пространственной сетки полимера, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается потоком подвижной фазы.

В процессе элюирования молекулы, размер которых превышает размер пор гранул (высокомолекулярные соединения), не проникают в гранулы геля и движутся с высокой скоростью вместе с растворителем только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размер которых меньше размера пор гранул (низкомолекулярные соединения), диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание растворителем (элюирование) из колонки замедляется (рис. 3.5). Поскольку степень диффузии в гранулы геля зависит от размеров молекул, вещества элюируются с колонки в порядке уменьшения их молекулярной массы. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем больший объем элюента требуется для вымывания его из колонки.

Рис. 3.5. Принцип гель-фильтрации

Распределение вещества по колонке, заполненной гранулами геля, зависит от общего объема растворителя внутри и снаружи гранул геля. Это распределение определяется коэффициентом распределения (K_av), который зависит от размера молекул вещества.

Коэффициент распределения K_av (available – доступный) характеризует движение хроматографической зоны вещества вдоль колонки при гель-фильтрации и определяет долю пор гранул геля, которую может занимать данный белок. K_av рассчитывается из соотношения

(3.1)

где K_av – коэффициент распределения; V_e – объем элюирования данного белка, мл; V_o – свободный объем колонки (объем жидкости между гранулами геля), мл; V_t – объем пустой колонки, мл.

Свободный объем колонки обычно определяют по объему элюирования голубого декстрана 2000 (молекулярная масса 2 · 10⁶ Да), не проникающего в гранулы геля. Объем пустой колонки вычисляют математически как объем цилиндра, используя ее длину и внутренний диаметр, или экспериментально по объему воды, необходимой для ее заполнения. Для сферических гранул V_o составляет 30-35% V_t в зависимости от плотности упаковки материала. Поэтому полезный диапазон V_e лежит в пределах 80% от объема столбика геля, т. е. составляет около 55% V_t. Следовательно, объем элюирования белка всегда меньше или равен объему пустой колонки.

Как видно из соотношения (3.1), K_av прямо пропорционален объему элюирования данного белка. Для крупных молекул, двигающихся по колонке в свободном объеме и отсутствующих в растворителе внутри гранул геля, K_av = 0 (V_e = V_o). Для мелких молекул, равномерно распределяющихся в растворителе внутри и снаружи гранул геля и требующих большого объема элюирования, K_av = 1. Молекулы средних размеров частично проникают в гранулы геля и для них 0 < K_av < 1. Они двигаются вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные, и для них оказывается доступной только часть объема неподвижной фазы. Следовательно, скорости перемещения отдельных белков по колонке обратно пропорциональны их коэффициентам распределения.

Элюент и параметры матрицы выбирают в соответствии с растворимостью и молекулярной массой исследуемого белка. В зависимости от размеров пор гранул используют ряд сефадексов – G-200, G-100, G-75, G-50, G-25 и др. Кроме того, разные типы сефадексов различаются величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с различными размерами молекул, а следовательно, и молекулярными массами. Номер марки сефадекса указывает на степень набухания его в воде и определяет десятикратное количество воды, которое может удержать 1 г сухого сефадекса. Например, 1 г сефадекса G-25 способен поглотить 2,5 мл воды. Для обессоливания белковых растворов используют сефадексы G-25 и G-50. Следует помнить, что белок будет элюироваться с колонки в том растворе, которым она была уравновешена. Поэтому неважно, в каком буферном растворе образец наносится на колонку.

Длина колонки должна в 20-40 раз превышать ее диаметр. Обычно используют колонки диаметром 2-5 см и длиной 50-100 см. Гель подбирают таким образом, чтобы молекулярная масса выделяемого белка приходилась примерно на середину кривой молекулярно-массового распределения белков для данного геля. Концентрация белка в растворе должна быть не выше 30 мг/мл, в противном случае раствор разводят. Так как эффективный объем фракционирования составляет приблизительно половину объема колонки, четкость разделения обусловлена тем, что образец наносится в малом объеме, который не должен превышать 3% от общего объема колонки.

Сухие гранулы геля выдерживают в выбранном буферном растворе в течение суток (при атмосферном давлении), в результате чего они набухают. Если набухание геля проводить при пониженном давлении, время сокращается до 1-2 ч. Объем суспензии должен не более чем в 2 раза превышать объем осевшего материала. Колонку заполняют через воронку полученным гелем при открытом выходе нижнего адаптера, добавляя гель порциями и не давая суспензии полностью осесть. Стенки колонки слегка простукивают, что способствует удалению пузырьков воздуха и равномерному заполнению колонки. После заполнения колонки следят за тем, чтобы над слоем сорбента всегда находился слой жидкости. Колонку следует заполнять в один прием при постоянном перемешивании суспензии, чтобы предотвратить разделение гранул по размерам в процессе их оседания. Для уменьшения взмучивания верхнего слоя сорбента над ним помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку закрывают верхним адаптером и присоединяют его к резервуару с элюентом через перистальтический насос для поддержания постоянного давления и сохранения постоянной скорости подачи элюента.

Перед нанесением образца колонку для гель-фильтрации уравновешивают буферным раствором. Затем дают буферу впитаться в поверхность геля, закрывают выход из нижнего адаптера и аккуратно наносят образец с помощью пипетки. Когда весь образец будет нанесен, открывают выход из нижнего адаптера и дают образцу впитаться в поверхность геля. Остатки образца со стенок колонки смывают небольшим объемом буферного раствора, затем заливают последний до верха колонки, подсоединяют верхний адаптер и проводят гель-фильтрацию, осуществляя непрерывную подачу элюента с определенной скоростью при помощи перистальтического насоса.

Элюат собирают порциями с помощью коллектора фракций, которые анализируют с помощью спектрофотометра при 280 нм (максимум поглощения белков). По полученным данным строят график зависимости Е ²⁸⁰ от номера фракции или объема элюата (профиль элюирования или хроматограмма). Возможна непрерывная регистрация хроматограмм с помощью УФ-детектора.

По окончании работы колонку промывают тремя объемами буферного раствора, закрывают и оставляют на хранение. В случае длительного хранения колонки для предотвращения развития микрофлоры в буферный раствор при промывании колонки добавляют азид натрия (NaN₃) в концентрации 10^-3М.

Объем элюирования индивидуального белка (V_e) – это объем элюата, собранного с момента внесения в колонку образца до момента выхода из колонки данного белка. Он соответствует максимуму хроматографического пика на хроматограмме.

При определении молекулярной массы исследуемого белка предварительно проводят калибровку колонки, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой (белки-маркеры) в тех же условиях, и определяют объемы элюирования для каждого из них. На основании этого строят калибровочный график зависимости молекулярной массы (в логарифмической шкале) белков-маркеров от объема элюирования или связанных с ним параметров, например коэффициента распределения белка между подвижной и неподвижной фазами K_av (рис. 3.6). Этот параметр в отличие от объема элюирования более стабилен и не зависит от объема колонки.

Рис. 3.6. Калибровочный график для колонки с сефадексом G-200

Адсорбционная хроматография. Разновидностью жидкостной хроматографии является адсорбционная хроматография, основанная на избирательной адсорбции веществ на твердых адсорбентах с высокоразвитой поверхностью.

В жидкостно-адсорбционной хроматографии разделение происходит за счет установления адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами. Это определяется процессами адсорбции-десорбции молекул на поверхности носителя. Адсорбция обусловлена совокупностью взаимодействий молекул разделяемых веществ и растворителей с поверхностью адсорбента (дипольные, ионные взаимодействия, водородные связи, ван-дер-ваальсовы силы). В ходе разделения молекулы растворенного вещества и растворителя конкурируют с участками связывания на поверхности адсорбента. Степень адсорбции вещества можно регулировать, меняя либо характеристики распределяемого вещества (например, заряд присутствующих в растворе частиц), либо свойства элюента. В результате этих изменений происходит конкурентное образование (или разрушение) множественных контактов между растворенным веществом, растворителем и адсорбентом.

Эффективность адсорбционной хроматографии зависит от процессов диффузии и массопередачи как в подвижной, так и в неподвижной фазах.

Исследуемую смесь, растворенную в подходящем растворителе, пропускают через колонку, заполненную адсорбентом. При этом компоненты смеси в силу их различий в коэффициентах адсорбции распределяются в колонке ступенчато и перемещаются вдоль слоя адсорбента с потоком подвижной фазы с разными скоростями. Коэффициент адсорбции – это отношение массы адсорбированного на поверхности носителя вещества к концентрации вещества в подвижной фазе. В верхней части колонки будет находиться компонент с более высоким коэффициентом адсорбции и низкой скоростью перемещения вдоль колонки, а в нижней части – компонент с более низким коэффициентом адсорбции и высокой скоростью перемещения. Если исследуемые соединения окрашены, то при их разделении можно видеть движение по колонке окрашенных полос.

Для правильного выбора условий хроматографического разделения смеси веществ необходимо знание изотерм адсорбции каждого из компонентов. Изотерма адсорбции представляет собой зависимость концентрации растворенного вещества в неподвижной фазе от концентрации его в подвижной фазе при данной температуре. Изотерма адсорбции описывает соотношение между равновесными концентрациями растворенного вещества в неподвижной и подвижной фазах. Выбор хроматографической системы должен проводиться с учетом требования линейности изотерм адсорбции, когда коэффициент распределения не зависит от концентрации вещества в подвижной фазе. Если состав смеси неизвестен, условия разделения подбирают экспериментальным путем.

При выборе неподвижной фазы необходимо учитывать удельную сорбционную способность сорбента, которая тем выше, чем мельче частицы (гранулы) сорбента и пронизывающие их поры. Важными качествами сорбента являются также его полная нерастворимость в жидком элюенте и химическая инертность.

Из большого числа поверхностно-активных веществ, применяемых в качестве неподвижной фазы в адсорбционной хроматографии, для выделения белков широко используют гели фосфата кальция, в частности гидроксиапатит (Са₅ОН(РО₄)₃). Эта форма фосфата кальция устойчива в широкой области рН и обладает большей стабильностью. Гидроксиапатит готовят смешиванием растворов СаCl₂ и Na₂HPO₄. Образующийся осадок СаHPO₄ · 2Н₂О под действием концентрированной щелочи гидролизуется в другую разновидность фосфата кальция – гидроксиапатит.

Ионообменная хроматография. Является методом, в основе которого лежит обратимый стехиометрический обмен между ионами анализируемых веществ, находящимися в жидкой подвижной фазе, и ионизированными группами сорбента-ионита, являющегося неподвижной фазой. Разделение основано на различии в значениях суммарных зарядов веществ или степени ионного сродства веществ к ионообменным центрам сорбента.

Распределение вещества между фазами зависит от силы электростатического взаимодействия ионов или заряженных групп в молекуле вещества с заряженными группами ионообменника. Это взаимодействие определяется как природой самого вещества (и ионообменника), так и свойствами жидкой среды, в которой оно происходит (рН и концентрацией нейтрализующих заряды противоионов).

В качестве твердых сорбентов применяют ионообменные материалы или иониты. Ионообменные материалы – это природные или синтетические нерастворимые полиэлектролиты, имеющие пористую структуру и содержащие ионизированные группы. Они могут поглощать положительно или отрицательно заряженные ионы из контактирующего с ними раствора электролита путем обмена их на эквивалентное количество собственных противоионов, переходящих в раствор.

Каждый ионит способен поглощать лишь определенное количество ионов. Эта величина называется адсорбционной емкостью ионита и выражается в миллиграммах (миллиграмм-эквивалентах) сорбируемого иона на единицу объема или массы ионита при значениях рН, соответствующих его 100%-ной ионизации. Для низкомолекулярных ионов она совпадает с концентрацией ионогенных групп. На емкость ионита влияют рН раствора, размер зерен ионита, число функциональных групп в матрице, размер сорбируемых молекул или ионов.

Существует два типа ионитов – катионо- и анионообменники (катиониты и аниониты). Катиониты содержат отрицательно заряженные группы и способны к обмену катионов, притягивая их из подвижной фазы. Аниониты содержат положительно заряженные группы и способны к обмену анионов. Заряд иониту придают кислые и основные группы атомов, называемые фиксированными ионами. К ним относятся: кислые -SO₃H, -COOH- и другие группы в катионитах и основные -CH₂NR₂, -CH₂N⁺R₃- и другие группы в анионитах.

Положительный или отрицательный заряд ионита компенсируется зарядом ионов противоположного знака, называемых противоионами (ионы водорода, катионы металлов, хлорид-ионы, гидроксид-ионы, иногда ионы буферного раствора). Они исходно подразумеваются в составе ионогенных групп сорбента и обладают в пределах ионита определенной подвижностью, что и обусловливает способность ионита к обмену ионов. Противоионы в растворе взаимодействуют с ионами ионита на расстоянии и связываются с ними электростатическими силами взаимного притяжения.

В сухом виде продажные ионообменники поставляются вместе с противоионами (ионообменные материалы марки Toyopearl выпускаются в виде водных суспензий). Называя их, принято говорить о форме ионообменника. Например, если катионит находится в Н⁺- или Na⁺-форме, это означает, что его кислые ионогенные группы нейтрализованы соответственно противоионами Н⁺ или Na⁺. Анионообменники производятся в ОН^-- или Cl^--форме.

В зависимости от типа ионогенных групп ионообменники разделяют на сильные и слабые. Сильные иониты, функциональные группы которых образованы сильными кислотами или основаниями, остаются полностью ионизированными во всем диапазоне рабочих значений рН (3-11), при которых может идти фракционирование биологических молекул. Слабые иониты, функциональные группы которых образованы слабыми кислотами или основаниями, оказываются ионизированными не полностью и лишь в ограниченной области значений рН. Их ионизацией можно управлять путем изменения рН элюента в пределах рабочих значений рН.

Ионный обмен, как правило, происходит очень быстро, поэтому скорость всего процесса в целом лимитируется скоростью диффузии ионов через ионит. Процесс ионного обмена состоит из следующих этапов:

· диффузия иона к поверхности ионита;

· диффузия иона внутрь гранул ионита к ионообменному участку (эта стадия является лимитирующей для всего процесса ионного обмена);

· обмен ионов на ионообменном участке (этот процесс является равновесным);

· диффузия обмениваемого иона из гранул ионита к его поверхности;

· десорбция элюентом и диффузия обменявшегося иона в окружающий раствор.

Ионообменные материалы представляют собой типичные гели. Их каркас, или матрица, состоит из высокополимерной пространственной сетки, в которой закреплены фиксированные ионы. Введение фиксированных ионов увеличивает гидрофильные свойства матрицы, в результате чего матрица приобретает способность к набуханию в водных растворах, а ионит превращается в полиэлектролит. Однако способность ионитов к набуханию в водных растворах ограничена благодаря наличию в полимерной молекуле поперечных связей или сшивок.

Для выделения белков используют природные и синтетические ионообменные материалы, обладающие высокой степенью гидрофильности. Белки могут быть разделены как на катионитах, так и на анионитах. Выбор типа ионита определяется устойчивостью белка в определенном диапазоне значений рН. Эффективная адсорбция белков происходит при значениях рН, отстоящих не менее чем на единицу от pI (изоэлектрической точки). В области рН < pI - 1 (в растворе находится больше положительно заряженных ионов, чем отрицательных) белки можно хроматографировать на катионитах, а в области рН > pI + 1 (в растворе имеется больше отрицательно заряженных ионов, чем положительных) – на анионитах. Изменение рН в направлении к изоэлектрической точке белка (в растворе находится одинаковое число положительно и отрицательно заряженных ионов) способствует десорбции белков.

Для разделения кислых (суммарный заряд белка отрицательный) и нейтральных белков используют аниониты, для разделения основных белков (суммарный заряд белка положительный) – катиониты.

К природным ионообменникам относятся ионообменники на основе целлюлозы и декстранов, содержащих чаще всего в качестве ионогенных групп карбоксиметильную и диэтиламиноэтильную.

Для целлюлозы характерны высокая степень гидрофильности и склонность к образованию многочисленных водородных связей между линейными цепями полимеров.

Адсорбционная емкость ионообменников в отношении белков зависит в основном от размеров белковых молекул с позиций легкости их проникновения в поры матрицы ионита и скорости диффузии в жидкой фазе. Чем мельче молекулы белка, тем в большей степени белок адсорбируется. Молекулы небольших белков связываются в количестве более 100 мг/мл, но молекулы крупных белков (с молекулярной массой более 10⁶ Да) не задерживаются большинством целлюлозных ионообменников. Здесь проявляется практически тот же эффект, что и при гель-фильтрации: крупные молекулы связываются только с поверхностью ионита и не могут пройти внутрь частиц адсорбента, поэтому емкость ионита для них очень низка.

Различают два типа ионообменников на основе модифицированной целлюлозы и декстранов (сефадексов): катионообменники – КМ-целлюлоза и КМ-сефадекс (к ОН-группе присоединена карбоксиметильная группа -СН₂СООН); анионообменники – ДЭАЭ-целлюлоза и ДЭАЭ-сефадекс (к ОН-группе присоединена диэтиламиноэтильная группа -СН₂-СН₂-N=(C₂H₅)₂). КМ-целлюлоза обладает свойствами слабого катионита и используется для разделения основных и нейтральных белков. ДЭАЭ-целлюлоза – слабый анионит, используется для разделения кислых и нейтральных белков (рис. 3.7).

Модифицированные сефадексы выпускаются на основе только двух типов сефадексов – G-25 и G-50. Размеры пор у модифицированных сефадексов значительно выше, чем у исходных типов матриц.

Иониты на основе целлюлозы имеют меньшую емкость, чем ионообменные сефадексы.

К синтетическим ионообменникам относятся ионообменники на основе полиоксиэтилена, содержащего карбоксиметильную и диэтиламиноэтильную группы – КМ- и ДЭАЭ-Toyopearl.

При выборе элюента необходимо учитывать природу, концентрацию, рН и емкость буферного раствора. Поддержание рН в ходе ионообменной хроматографии имеет важное значение, так как ионные взаимодействия сильно зависят от рН, а буферные растворы содержат ионы, которые могут принимать участие в процессе ионного обмена. Рекомендуется работать с буферными растворами, содержащими простые анионы (Cl^-, CH₃COO^-) и катионы (NH₄⁺, K⁺, Na⁺, H- трис ⁺).

Для подготовки ионообменника к работе сухой ионит выдерживают в выбранном буферном растворе в течение суток (при атмосферном давлении) или 1-2 ч (при пониженном давлении) для набухания.

Затем ионит несколько раз переводят из одной формы в другую: катиониты переводят из Н⁺-формы в Na⁺-форму и наоборот, а аниониты – из ОН^--формы в Cl^--форму и наоборот. В процессе такой обработки стабилизируется структура ионита и его функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождается от низкомолекулярных примесей. Для этого к аниониту добавляют 15 объемов 0,5 М HCl, а к катиониту – такой же объем 0,5 М NaOH и тщательно перемешивают. Этим обеспечивается максимальная ионизация их ионогенных групп. Через 30 мин иониты фильтруют или отделяют декантацией и промывают водой до рН ~ 4 (для анионита) и рН ~ 8 (для катионита), поскольку ионы Н⁺ и ОН^- из воды будут замещать противоионы Na⁺ и Cl^-, за счет чего будет поддерживаться слабокислое или слабощелочное значение рН промывной воды. После промывки водой катионит и анионит переводят соответственно в Н⁺- и ОН^--форму: катионит обрабатывают 0,5 М HCl, а анионит 0,5 М NaOH в течение 30 мин. Эту операцию повторяют со свежей порцией кислоты или щелочи, а затем промывают ионит водой до нейтрального значения рН промывной воды.

Вышеописанную процедуру проводят вне колонки, включая начальную стадию уравновешивания колонки буферным раствором.

Далее катионит в Н⁺-форме и анионит в ОН^--форме переводят в полностью ионизированную солевую форму, насыщенную противоионами – катионами (NH₄⁺, Na⁺, K⁺) для катионитов и анионами (CH₃COО^-, Cl^-) для анионитов, что препятствует изменению рН. Для этого через колонку с ионитом пропускают буферный раствор с теми же значениями рН и ионной силы, что и буферный раствор, в котором растворены белки.

Ниже представлены реакции ионного обмена на примере взаимодействия катионита и анионита с солевым раствором.

При взаимодействии соли с катионитом в Н⁺-форме происходит обмен катионов:

катионит^-…Н⁺ + Na⁺Cl^- «катионит^-…Na⁺ + H⁺Cl^-

а при взаимодействии соли с анионитом в ОН^--форме происходит обмен анионов:

анионит⁺…ОН^- + Na⁺Cl^- «анионит⁺…Cl^- + Na⁺ОН^-

В ионообменной хроматографии применяют стеклянные колонки цилиндрической формы длиной 40-50 см и диаметром 2-4 см. Заполнение колонки ионитом проводят так же, как и в методе гель-фильтрации. Перед нанесением образца колонку уравновешивают элюирующим буферным раствором до тех пор, пока рН выходящего из колонки элюата не будет равен рН элюента. Объем буферного раствора, необходимого для уравновешивания, составляет около 5-7 объемов колонки.

Наносимая на колонку смесь белков должна быть растворена в том же буферном растворе, который использовали для уравновешивания колонки. Концентрация адсорбируемого белка в растворе должна составлять не более 5-7 мг/мл. Если исследуемый белок связывается с ионообменником прочно, объем наносимого белкового раствора не имеет значения. Если исследуемый белок связывается с ионообменником слабо, наносимый объем должен быть по возможности небольшим (не более 1-2% от объема колонки).

При нанесении белков на колонку используют буферные растворы с низкой ионной силой и высокой буферной емкостью. Противоионы буферного раствора в низкой концентрации не блокируют заряды ионогенных групп ионита, и, следовательно, последние почти все доступны для взаимодействия с ионогенными функциональными группами белка. При этом белки оказываются связанными с ионитом и практически не продвигаются по колонке.

Нанесение белкового раствора может осуществляться до полного насыщения колонки выделяемым белком вплоть до его появления в элюате.

В процессе ионного обмена противоионы ионита замещаются функциональными группами белков, при этом прочность связывания белка с ионообменником пропорциональна его заряду (рис. 3.7).

Рис. 3.7. Структура ионообменных целлюлоз и общий принцип ионного обмена

Элюирование белков с колонки проводят буферным раствором с линейно повышающейся ионной силой обычно от 0 до 0,6 М за счет добавления к нему солей KCl или NaCl. При этом среднее число связей, удерживающих белок на ионите, постепенно уменьшается, так как противоионы соли в высокой концентрации блокируют заряды ионогенных групп ионита, и, следовательно, последние недоступны для взаимодействия с ионогенными функциональными группами белка. При этом адсорбируемость белков на ионите снижается, и они выходят из колонки. Белки из колонки элюируются в порядке возрастания суммарного заряда их молекул. Элюирование проводят до тех пор, пока экстинкция элюата не станет равной экстинкции исходного элюента.

Элюат собирают порциями с помощью коллектора фракций и анализируют на содержание белка с помощью спектрофотометра.

Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически по поглощению при 280 нм и строят профиль элюирования. При построении графика используют две оси ординат: на одной оси откладывают поглощение при 280 нм, а на другой – концентрацию KCl (рис. 3.8). Из такого графика легко определить, при какой концентрации KCl элюируется с колонки тот или иной белок. Зная количество белка, нанесенного на колонку, рассчитывают относительное содержание белка (в процентах) в отдельных фракциях.

Рис. 3.8. Типичный профиль элюирования белков с ионообменной колонки линейным градиентом концентрации KCl

Для идентификации белков, элюируемых с колонки, содержимое пробирок, соответствующее отдельным пикам на профиле элюирования, подвергают диализу, исследуют методом электрофореза в полиакриламидном геле и определяют ферментативную активность.

Ионообменники можно использовать многократно, поэтому по окончании работы их следует регенерировать. Очистку ионита от остатков сорбированных веществ осуществляют промывкой его 4-5-ю объемами 2 М раствора KCl или NaCl. После этого ионит промывают водой и уравновешивают буферным раствором.

Иониты во влажном состоянии хранят в течение непродолжительного времени в солевой форме в присутствии антисептиков – азида натрия (10^-3 М) или хлороформа. Если предусматривается продолжительное хранение ионита (в течение нескольких месяцев), его переводят в сухое состояние. Для этого ионит извлекают из колонки, промывают водой, затем последовательно обрабатывают 30, 50 и 70%-ным этанолом и фильтруют на стеклянном фильтре. Осадок высушивают на воздухе, периодически растирая шпателем образующиеся комки.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это особый тип адсорбционной хроматографии и наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков, основанный на биоспецифическом взаимодействии молекул белка, находящихся в подвижной фазе, с комплементарными им молекулами веществ (лигандов), «пришитых» к неподвижной фазе. Биоспецифическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью по типу «антиген-антитело» или «фермент-субстрат» и др.

Любой из компонентов вышеуказанных и подобных им биоспецифических пар можно закрепить на матрице в качестве так называемого лиганда. С его помощью второй партнер пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами, и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса. Иногда это может быть не одно, а несколько родственных или схожих по своей структуре веществ, «узнающих» один и тот же лиганд, например изоферменты или различные виды антител к одному и тому же антигену.

К инертному полимеру ковалентно присоединяется соединение (лиганд), обратимо и специфично связывающееся с данным белком. При пропускании через колонку с нерастворимым носителем, связанным с аффинным лигандом, раствора белков за счет комплементарного связывания белка с лигандом в колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок. Другие белки или примеси, не обладающие сродством к данному лиганду, беспрепятственно удаляются с подвижной фазой. Прочность удерживания того или иного белка в колонке зависит от степени его сродства к аффинному лиганду и конкретных условий хроматографирования. Для элюирования адсорбированного белка с помощью элюента, содержащего свободный лиганд, нарушают биоспецифическую связь «пришитого» лиганда с белком, что позволяет быстро вывести последний из колонки.

Нерастворимая матрица (носитель) для аффинной хроматографии должна удовлетворять следующим требованиям:

· матрица должна быть пористым гидрофильным полимером, который можно производить в виде частиц нужной формы и размера, что обеспечивает свободный доступ макромолекул к «пришитому» лиганду и отсутствие гидродинамического сопротивления элюенту;

· матрица должна оставаться прочной и химически устойчивой в процессе присоединения аффинных лигандов и в условиях хроматографирования;

· лиганд должен быть присоединен к матрице таким образом, чтобы при связывании его с белком не возникало стерических затруднений; иммобилизованный лиганд должен связываться с исследуемым белком легко и достаточно прочно, чтобы обеспечить удаление примесей путем промывки сорбента соответствующим буферным раствором; в то же время связывание должно быть обратимым, чтобы белок можно было легко «снять» с колонки;

· неспецифическая адсорбция должна отсутствовать.

Кроме вышеперечисленных, следует добавить требование наличия в носителе достаточного числа химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалентно связывать с матрицей различные биологические молекулы – лиганды. Наиболее удобными с этой точки зрения являются ОН-группы полисахаридных матриц – агарозы и сефадексов.

Применительно к аффинной хроматографии белков к вышеназванным требованиям следует добавить необходимость крупных пор у матрицы, что характерно для агарозы (сефарозы – промышленное название сферического геля агарозы). Сферические гранулы этой матрицы имеют поры, доступные для макромолекул с молекулярной массой порядка нескольких миллионов дальтон. Помимо обычных используют химически сшитые матрицы типа сефарозы. Однако следует иметь в виду, что около половины ОН-групп в них заняты поперечными сшивками, поэтому емкость таких сорбентов заметно ниже. Вместе с тем поперечно-сшитые гранулы агарозы не разрушаются и сохраняют свои размеры как под давлением, так и при смене рН буферного раствора.

Наиболее широко в качестве аффинной матрицы используется «Сефароза 4В» - 4%-ный гель агарозы, предназначенный для фракционирования белков с молекулярной массой 3 · 10⁵-3 · 10⁶ Да.

Каждый сорбент характеризуется эффективной удельной емкостью – максимальным количеством вещества, например белка, которое может связаться с ним (в расчете на 1 мл) за достаточное для установления равновесия время, так что в жидкой фазе концентрация этого вещества будет практически равна нулю.

В качестве аффинных лигандов используют любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Всем им свойственна определенная биоспецифичность – индивидуальная или групповая. Под индивидуальной биоспецифичностью понимают строгую взаимную специфичность (сродство) двух молекул (например, антигена и антитела); под групповой – такой вид биоспецифического взаимодействия, когда лиганд может связывать целую группу родственных веществ (например, никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺), взаимодействующий со всеми ферментами, для которых он служит коферментом). Лиганды с групповой специфичностью в некоторых случаях не уступают по избирательности лигандам с индивидуальной специфичностью и имеют явное преимущество в том случае, когда стоит задача разделения нескольких веществ, обладающих сродством к одному и тому же лиганду. Если степень этого сродства не одинакова для разных веществ смеси, то разделение этих веществ может быть осуществлено хроматографически в ходе их поочередного элюирования с сорбента (при использовании различных конкурентных элюентов), что невозможно сделать в случае лиганда с индивидуальной специфичностью.

В качестве аффинных лигандов с групповой специфичностью используют триазиновые красители (торговое название – «проционовые красители»), ингибиторы и кофакторы ферментов. Триазиновые красители обладают очень высоким сродством к дегидрогеназам. Среди кофакторов ферментов универсальными аффинными лигандами служат нуклеозидфосфаты: 5¢-аденозинмонофосфат (5¢-АМР), 2¢,5¢-аденозиндифосфат (ADP), НАД⁺ и НАДФ⁺. Это обусловлено тем, что многие ферменты проявляют свою активность в присутствии этих коферментов. Концентрация аффинных лигандов обычно составляет 10^-1-10^-3М.

Желательно, чтобы присоединение лиганда к матрице происходило в точке, не совпадающей с областью взаимодействия белка с лигандом. При закреплении лиганда на матрице следует также учитывать необходимость сохранения биологической активности лиганда – аффинного сродства к субстрату.

Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо не только связывание аффинного лиганда, но и полное удаление всего аффинного лиганда, нековалентно связанного с носителем.

В аффинной хроматографии чаще всего применяют стеклянные или полимерные колонки цилиндрической формы длиной до 10 см и диаметром 1-2 см. Заполнение колонки связанной с лигандом матрицей проводят так же, как и в методе гель-фильтрации. Перед нанесением образца колонку уравновешивают исходным элюирующим буферным раствором до тех пор, пока рН выходящего из колонки раствора не будет равен исходному. Объем буферного раствора, необходимого для уравновешивания, составляет около 2–3 объемов колонки.

Наносимая на колонку смесь белков должна быть растворена в том же буферном растворе, который использовали для уравновешивания колонки. Концентрация адсорбируемого белка в растворе должна составлять не более 5-7 мг/мл. Объем наносимого белкового раствора зависит от емкости сорбента.

При нанесении белков на колонку используют буферные растворы, способствующие сохранению нативной структуры выделяемого белка и максимально уменьшающие неспецифическую адсорбцию. Буферный раствор должен иметь такие значения рН и ионной силы, чтобы обеспечивать оптимальные условия для связывания белка с сорбентом.

После этого осуществляют промывку сорбента исходным буферным раствором для удаления неспецифически адсорбировавшихся примесей.

Затем проводят элюирование белка с колонки, используя специфический (конкурентный) или неспецифический варианты элюирования. При специфическом элюировании в состав элюента вводят свободный лиганд (тот же, который «пришит» к матрице, или другой), за счет более высокой концентрации которого белок элюируется с колонки (рис. 3.9). При неспецифическом элюировании чаще всего изменяют рН элюента, вследствие чего меняется конформация фермента и прочность его взаимодействия с лигандом резко уменьшается, в результате фермент элюируется с колонки.

Рис. 3.9. Принцип аффинного выделения глюкозосвязывающего белка

Элюат собирают порциями с помощью коллектора фракций, анализируют содержание белка во фракциях с помощью спектрофотометра по поглощению при 280 нм, строят профиль элюирования и устанавливают объем элюирования исследуемого белка. Для идентификации белков, элюируемых с колонки, в содержимом пробирок, соответствующем отдельным пикам на профиле элюирования, определяют ферментативную активность.

Адсорбенты можно использовать многократно при условии, что после элюирования белков с колонки их немедленно промывают растворами мочевины или додецилсульфата натрия и хранят в присутствии антисептика.

Основным преимуществом аффинной хроматографии является ее очень высокая избирательность, позволяющая выделять из смеси биологически активных веществ компоненты, присутствующие в ничтожно малых количествах, в одну стадию и с высокой степенью очистки. Вместе с тем сам способ связывания вещества с адсорбентом, несмотря на прочность этой связи, является в отличие от других видов хроматографии идеально мягким и не угрожает нативности молекул. Следует отметить также, что аффинную хроматографию ввиду избирательности адсорбции и очень высокого значения коэффициента распределения адсорбируемого вещества отличает возможность использовать большие объемы исходных веществ и в ходе ступенчатого элюирования осуществлять их очень эффективное концентрирование.