Микроскопическое изучение колоний

Из части колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения в достаточном количестве чистой культуры. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 – 24 ч при температуре 37 С.

Третий день.Из выросшей на скошенном агаре культуры делают мазки, окрашивают по Граму. О чистоте культуры судят по однородности роста, формы, размера и окраски микроорганизмов. Для идентификации выделенной чистой культуры кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей микроорганизмов необходимо определить их ферментативные и антигенные свойства, фаго- и бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую специфичность.

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы, используют среды Гисса.Протеолитические ферменты у бактерий обнаруживают с помощью посева их в столбик желатина.

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода и других соединений. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы микроорганизмов в МПБ или 1% пептонную воду. Посевы выдерживают в термостате в течение 24 – 72 ч.

Антигенные свойства выделенной культуры изучают с помощью реакции агглютинации.

Вирулентность определят путем заражения эксперементальных животных.

Видовую принадлежность аэробных бактерий определяют путем сравнения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

16. Царство вирусов. Классификация. Морфология и строение вирионов. Химический состав, функции структурных элементов. Прионы. Вироиды. Работы Д.И.Ивановского.Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства: рибовирусы и дезоксирибовирусы. Все вирусы подразделяют на две большие группы: ДНК-содержащие вирусы (дезоксивирусы) и РНК-содержащие вирусы (рибовирусы). Затем каждую из этих групп подразделяют на вирусы с двухнитчатой и однонитчатой нуклеиновыми кислотами. Следующий критерий - тип симметрии вирионов (зависит от способа укладки капсомеров), наличие или отсутствие внешних оболочек и т.п.Вирусы - это мельчайшие микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопротеид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой – капсидом. Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах; они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую, сперматозоидную. Вирусы состоят из следующих основных компонентов: 1. Сердцевина - генетический материал (ДНК либо РНК), который несет информацию о нескольких типах белков, необходимых для образования нового вируса.2. Белковая оболочка, которую называют капсидом. Она часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии.3. Дополнительная липопротеидная оболочка. Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина и встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес).Капсид и дополнительная оболочка несут защитные функции, как бы оберегая нуклеиновую кислоту. Кроме того, они способствуют проникновению вируса в клетку. Полностью сформированный вирус называется вирионом. Химический состав вирионовВирусные ДНК. По структуре различают двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную и кольцевую формы. В каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, но на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180º) повторы. Нуклеотидные повторы являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном. Вирусная РНК. Вирусные РНК могут быть однонитевыми и двунитевыми. При этом РНК может быть линейной и кольцевой. Однонитевые РНК по функции делятся на 2 группы: плюс-нить («+», позитивный геном) – Рнк, способные транслировать закодированную в ней информацию на рибосомы клетки-хозяина, т.е. выполнять функцию иРНК; минус-нить («-», негативный геном) – вирусные одноцепочечные РНК, служащие матрицей для образования иРНК. У двунитевых как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана в одной цепи. Вирусные белки, подразделяются на структурные и функциональные. Первые входят в состав вирусного капсида, которые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репродукции вирусов. Структурные белки у простых вирионов представлены капсидными белками, которые защищают нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их состав входят белки, несущие «адресную» функцию, заключающуюся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. У сложных вирионов капсидные белки выполняют также защитную функцию. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных ДНК и РНК. Имеются также внутренние гистоноподобные белки, обладающие антигенными свойствами. Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. Липидный и углеводный состав вириона определяется клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Ферменты вирусов. Вирусы содержат в составе капсида одну или две группы ферментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрипции, ко второй – ферменты, участвующие в проникновении вирусной унклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов. Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. Прио́ны — особый класс инфекционных агентов, чисто белковых, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных. Вироиды — это патогены растений, которые состоят из короткого фрагмента (несколько сотен нуклеотидов) высококомплементарной, кольцевой, одноцепочечной РНК, не покрытой белковой оболочкой.Впервые существование вируса (как нового типа возбудителя болезней) доказал в 1892 году русский учёный Д. И. Ивановский. После многолетних исследований заболеваний табачных растений, в работе, Д. И. Ивановский приходит к выводу, что мозаичная болезнь табака вызывается «бактериями, проходящими через фильтр Шамберлана, которые, однако, не способны расти на искусственных субстратах».Пять лет спустя, при изучении заболеваний крупного рогатого скота, а именно - ящура, был выделен аналогичный фильтрующийся микроорганизм. А в 1898 году, при воспроизведении опытов Д. Ивановского голландским ботаником М. Бейеринком, он назвал такие микроорганизмы «фильтрующимися вирусами». В сокращённом виде, это название и стало обозначать данную группу микроорганизмов.

17. Механизмы взаимодествия вирусов с соматической клеткой. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжает после их проникновения внутрь клетки. В результате развивается: продуктивная форма – происходит размножение, репродукция вируса, абортивная форма – ее нарушение на одном из этапов, интегративная форма – интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточныйгеном .Продуктивная инфекция. Стадии 1. Адсорбция – прикрепление вириона к клеточным рецепторам. Рецепторами вирусов являются прикрепительные белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нити или шипа. 2. Проникновение вируса в клетку хозяина. Пути:- рецепторно-опосредованный эндоцитоз – с помощью белков-клатринов образуются окаймленные пузырьки- виропексис – заключается в слиянии мембраны вирусного капсида с клеточной или ядерной мембраной с помощью F-белка суперкапсида. В результате капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид сбелком встраивается в ее плазматическую мембрану.- фагоцитоз - вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу. 3. Т ранспорт вируса внутри клетки – вирус с помощью мембранных внутриклеточных пузырьков переносится на рибосомы, ЭПС или в ядро. 4. «Раздевание» вириона – заключается в их освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. 5. Эклипс-фаза – вирион не обнаруживается при электронной микроскопии. Происходит репродукция вириона. Она носит дезъюнктивный характер, т.е. компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки. Стадия начинается с транскрипции и репликации вирусного генома. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит по триаде ДНК – иРНК – белок, но различие касается фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осуществляется несколькими путями. 1. Вирусы с негативным геномом имеют в своем составе вирусспецифичекую РНК-полимеразу или транскриптазу. Они синтезируют иРНК на матрице геномной РНК. Фермент содержится как в составе однонитевых, так и двунитевых РНК-содержащих вирусов.2. У вирусов с положительным геномом функцию иРНК выполняет сам геном, который транслирует содержащуюся в нем информацию на рибосомы клетки хозяина.3. У РНК-содержащих ретровирусов в составе имеется обратная транскриптаза, которая способна переписывать информацию с РНК на ДНК– обратная транскрипция. 6. Сборка вириона – состоит в образовании нуклеокапсидов Синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков в клетке происходит на разных структурах, но вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом. 7. Выход вирусных частиц из клетки - происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования. Интегративная (встраивающаяся) инфекция. Биологический смысл заключается в сохранении вирусной информации в составе клеточного генома и ее передаче потомству.Вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. Место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющимися в дНк сайтах при участии рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз. Вирус, интегрированный в клеточный геном, называют провирусом. Провирус может реплицироваться в составе клеточного генома пропорционально делению клетки. С увеличением числа копий провируса без его выщепления из клеточного генома может привести к встраиванию провируса в другую хромосому. Вщепление провируса и его проникновение в новую клетку может вызвать продуктивную инфекцию.У РНК-содержащих вирусов включение РНК в клеточный геном происходит путем обратной транскрипции. Сначала при помощи транскриптазы на матрице РНК образуется ДНК-транскрипт. Транскрипт является матрицей для образования второй нити. Затем двунитевой ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном (вирогения). В интегрированном состоянии вирусная ДНК может транскрибироваться в составе клеточного генома при участии клеточных РНК-полимераз.

Материальные основы наследственности микроорганизмов. Организация генетического материала у прокариотов, эукариотов, вирусов. Генотип и фенотип. Виды изменчивости. Модификации. Механизм. Фенотипические проявления.

Огромное значение в становлении и развитии молекулярной ге­нетики имел выбор бактерий и вирусов в качестве основных модель­ных систем для изучения общегенетических закономерностей. Упо­мянутые микроорганизмы в отличие от такого классического объек­та, как мушка дрозофила, обладают уникальными для генетических экспериментов свойствами.

1. Гаплоидностью, т.е. наличием одной хромосомы, что устраняет явление доминантности.

2. Высокой скоростью размножения обеспечивающей получение в лабораторных условиях многомиллиардных популяций в течение нескольких часов.3. Высокой разрешающей способностью методов генетического анализа бактерий и вирусов, позволяющей обнаружить их мутанты с частотой 1(Г9и ниже.

4. Половой дифференциацией, заключающейся в существовании донорных и реципиентных бактериальных клеток, соответственно отдающих или воспринимающих генетическую информацию.5. Наличием у бактерий обособленных фрагментов ДНК — плаз-мид, транспозонов и Is-последовательностей.

Современные достижения молекулярной генетики связаны также с разработкой методов генной инженерии — изолирования и перено­са отдельных генов из одних клеток прокариот или эукариот в дру­гие. Это создало поистине фантастические перспективы для получе­ния ранее неизвестных генотипов, прежде всего среди бактерий и вирусов, и заложило основу новейшей биотехнологии производства вакцин, интерферона, гормонов и других биологически активных веществ.Следующий этап в развитии медицинской микробиологии связан с открытием молекулярно-генетических закономерностей формирова­ния новых разновидностей и видов патогенных микроорганизмов. Это даст возможность прогнозировать их появление и распространение

среди населения разных регионов нашей планеты и своевременно про­водить соответствующие противоэпидемические мероприятия.

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ. ГЕНОТИП, ФЕНОТИП БАКТЕРИЙ И ГЕНОФОНД ИХ ПОПУЛЯЦИЙ

Материальной основой наследственности, определяющей ге­нетические свойства всех организмов, в том числе бактерий и виру­сов, является ДНК. Исключение составляют только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК. Од­нако в отличие от хромосомы эукариот гены прокариот организованы в более простую структуру, представляющую собой молекулу ДНК, часто замкнутую в кольцо. Молекулярная масса ДНК у бактерий срав­нительно велика: у Е. coli она равна 2 · 109.

Наряду с описанной структурой, называемой бактериальной хро­мосомой, или нуклеоидом, генетический материал у бактерий содер­жится во внехромосомных генетических элементах — плазмидах, которые могут находиться в автономном состоянии в цитоплазме клетки.

Гены, ответственные за синтез того или иного соединения, при­нято обозначать строчными буквами латинского алфавита, соответ­ствующими названию данного соединения со знаком «+». Например, his* — гистидиновый ген, lеи+* — лейциновый ген и т.д. Гены, кон­тролирующие резистентность к лекарственным препаратам, фагам, ядам, обозначают буквой г (resistent — резистентный). Например, резистентность к стрептомицину записывается знаком str1, а чувстви­тельность str*. Фенотип бактерий обозначают теми же знаками, что и генотип, но с прописной буквы.

Генотип микроорганизмов представлен совокупностью генов, определяющих его потенциальную способность к фенотипическому выражению записанной в них информации в виде определенных при­знаков. Условия окружающей среды способствуют проявлению (экс­прессии) генов или, наоборот, подавляют их функциональную актив­ность, выраженную в образовании определенных ферментов. У бак­терий, имеющих определенный набор генов, функцию каждого из них определяют не прямым, а косвенным путем на основании изменения или утраты соответствующего признака при утрате какого-либо уча­стка ДНК. Таким образом, заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения признака присущего исходному генотипу и штамму с мутировавшим геном. В генетичес­ких исследованиях мутировавшие гены служат маркерами, которые дают возможность судить об их передаче и функционирова­нии. Сцепленность таких маркеров с другими генами устанавливает­ся путем их передачи от донорных к реципиентным клеткам в опы­тах трансформации трансдукции и конъюгации. Это позволяет уста­новить их локализацию на бактериальной хромосоме и составить генетическую карту.

МОДИФИКАЦИИ

Фенотипические изменения какого-либо признака или не­скольких признаков микроорганизма называют модификациями. В отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вско­ре утрачиваются.

Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных мик­робных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. Такого рода изменчивость позволяет микробным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде и сохранять на должном уровне свою жизнеспособность.

Модификации проявляются в изменении морфологических, био­химических и многих других признаков с последующей их реверси­ей к первоначальному фенотипу после устранения действия фактора, вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохра­нении данной модификации.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответ­ствующих структурных генов, контролируемых регуляторными гена­ми. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафило­кокки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, раз­рушающий данный антибиотик.

К модификациям можно отнести включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного за­болевания.

К модификациям можно отнести также запрограммированные из­менения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определен­ные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Суще­ствует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приво­дит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы си­филиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.

Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образующиеся при этом L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. При выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактерио-статическими концентрациями антисептиков также можно получить их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или других признаков.

22.Мигрирующие генетические элементы бактерий: транспозоны, Is-последовательности, плазмиды. Характеристика. Свойства плазмид. Роль плазмид в детерминировании патогенных признаков и лекарственной устойчивости.Внехромосомные факторы непосредственно входят в сосотав микроорганизмов. Они представлены пламидами, транспозонами и Is-последовательностями, которые являются молекулами ДНК, отличающимися молекулярной массой,Объемом закодированной информации, способности к автономной репликации. Плазмиды, транспозоны и Is-последовательности не являются генетическими элементами. Жизненно-необходимыми для бактерий, так как они не несут информации о ситезе ферментов. Участвующих в пластическом или энергетическом обмене. Вместе стем. Они могут придавать бактериям определенные селективные преимущества(резистентность к а/б). Плазмиды либо не связаны с хромосомой,либо встроены в ее состав. Автономное состояние- сами реплицируются. Транспозоны и Is-последовательности всегда связаны с хромосоиой и не способны к самостоятельной репликации. Транспозоны -нуклеотидные последовательности(2000 до 20 500 пар нуклеотидов). Которые несут генетическую информацию. Необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации. А при перемещении- делеции и инверсии. Транспозоны могут находится в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы.Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДнК) на другой(плазмида) и наоборот. Кроме того они выполняют регуляторную и кодирующую функции, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов, разрушающих а/б.. Транспозоны имеют концевые структуры. Которые являются маркерами, позволяющих отличать их от других фрагментов ДНК. Is-последовательности - фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов, в них содержится информация. Необходимая только для их транспозиции, т.е. перемещение в различные участки ДНК. Функции:1. Координировать взаимодействие транспозонов,плазмид, и умеренных фагов. Как между собой так и с хромосомой; 2.вызывать инактивацию гена, в котором произошла интеграция Is-последовательности(вкл. Гена), либо будучи встроенным в хромосому, служить промотором. Который вкл или выкл. Транскрипцию генов, выполняя регуляторную функцию; 3 Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликацииВ свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены- неспособномсть реплицировать самостоятельно. Плазмиды несут 2 функции- регулторную и кодирующую. Первая- в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома,не способного к репликации его ф-я восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодрующая ф-я состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации,о которой судят по прирбретенному признаку, например образованию пилей(F- плазмида), резистентности к а/б. Переход плазмида в автономное состояние и реализация записанной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как Is-последовательностей и транспозонов – в любой участок. F- плазмида или половой фактор, представляет собой циркулярно замкнутую нить ДНК. Контролирует синтез половых ворсинок, которые способствуют эффективному спариванию бактерий- доноров с реципиентными клетками при конъюгации. R-плазмиды- определяет устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарственным препаратам. передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распростронению среды патогенных и условно- патогенных бактерий, ч то чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний.Они имеют сложное молекулярное строение, в их состав входят:r- ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы- Is-последовательности, транспозоны и tra-опероны. R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к какому либо а/б, контролирует синтез фермента, вызывающего его инактивацию или модификацию. В одном таком гене может содержатся несколько транспозонов. tra-оперон обеспечивает конъюгативность плазмиды, входит в состав R-плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды,которые могут передаватся от одной бактерии к другой путем трансдукции. Плазмиды патогенности - контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование. Бактериоциногенные плазмиды- контролируют синтез рода а/б веществ- бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов.они обнаружены в кишечных бактериях(колицины), бактерий чумы(пестицины),холерных вибрионов(вибриоцины). Колицины энтеробактерий представляют собой вещества белковой природы.Механизм бактерицидного действия неодинаков. Показано. Что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов(Е3) нарушает ф-ю рибосом, другой(Е2) является ферментом- эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий. Колициногеные плазмиды находятся в клетках энтеробактерий в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой Плазмиды биодеградации -несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии. Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий,обеспечивая селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека.