Капсулы. Жгутики.Пили. Методы выявления.Патогенные представители

Бактер. клетка окружена внешней оболочкой, кот. состоит из капсулы, капсулоподобной оболочки и клеточной стенки. От их состава зависят тинкториальные свойства. Капсулы бывают: микро-и макрокапсулы.

Микрокапсулы- это микрофибриллы из мукоподисахаридов, кот. Тесно прилегают к клеточной стенке.

Макрокапсулы – выраженный слизистый слой, кот.снаружи покрывает клеточную стенку.Состоит из полисахаридов. Макрокапсула у немногих видов патогенных микроорганизмомв – пневмококки

Капусулоподобная оболочка- липидо-полисахаридное оьразование, непрочно связанное с поверхностью клетки, может выделятся в окруж.среду

Функции капсулы: защитная, адгезивная. С ней могут быть связаны патогенные и адгезивные свойства. Капсула – окраска по Бури-Гинсу

Жгутики – располагаются на поверхности клеток. В состав входит белок флагелин (Сократ.белок). Жгутики прикрепляются к базальному телу(система нескольких дисков, вмонтированных в цитоплазмат.мембрану и КС)

Монотрихи – 1 жгутик на одном из полюсов

Амфитрихи – жгутики на обоих полюсах

Лофотрихи – пучок жгутиков

Перитрихи –по всей поверхности.

Обладают антигенными свойствами.

Функция – локомоторная

Пили – тонкие полые нити белковой природы, покрыв. Поверхность клеток. Не выполн. локомоторную функцию

Пили 1 общего типа обеспечивают адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина

Пили2 типа (половые – sex pili ) участвуют в коньюгации бактерий

8. Споры и спорообразование. Хим.состав и функц.значение спор. Методы выявления. Патогенные представители

Споры – форма сохранения наследств.информации бактериальной клетки в неблагоприятных условиях внешней среды. К патогенным представителям относятся bacillus и clostridium. Выявляются окраской по Пешкову и Ожешко. Отличие – по размеру спор.

Располагаются споры: центрально, субтерминально или терминально.

Процесс спорообразования:

Формируется спорогенная зона вокруг бактре.клетки (т.е.уплотненный участок цитоплазмы, внитри кот. - нуклеоид)

Затем образуется проспора путем отделения спорогенной зоны от остальной части цитополазмы (т.е.врастанием цитоплазмы)

Образование кортекса (сост.из пептидогликана)

Внешняя сторона мембраны покрывается плотной капсулой, сост.из белков, липидов, дипиколиновой кислоты(обуславл.термоустойчивость)

Затем вегет.часть клетки отмирает, а спора может сохранятся во внешней среде месяцами и годами(т.е. в нец малое содежрание воды, повыш.концентрация кальция)

При благприятн.условиях спора набухает, активируются ферменты, запускается метаболизм – образуется вегетат.клетка

Споры- это таксономический признак

23.Мутации, их классификации. Мутагены физические, химические, биологические. Молекулярный муханизм мутации(делеция, дупликация, инверсия). Репарации и их значение. Роль мутаций.Мутации - изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака.Их можно классифицировать по происхождению, характеру изменений в первичной структуре, Фенотипическим следствиям для мутировавшей бактериальной клетки.По происхождению делят на спонтанные и индуцированные.Первые составляют естественный фон, величина которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Мутации происходят в результате ошибочного включения в синтезируемую дочернюю цепь вместо одного азотистого основания другого некомплементарного имеющегося в родительской цепи. Причиной изменения естественного фона могут быть инсертационные мутации, которые возникают при встраивании в хромосому микробной клетки Is-последовательностей, транспозонов и плазмид. При этом фенотип мутации зависит от места их интеграции: если она происходит вблизи промотора, то нарушается ф-я регуляторного гена, а вблизи структурного гена- синтез закодированного в нем продукта. Индуцированные мутации- получают в эксперементе под влиянием каких-либо мутагенов.По к-ву мутировавших генов: Генные и хромосомные. Первые затрагивают один ген и чаще всего являются точковыми, вторые распростроняются на несколько генов. ТОчковые – замена или вставка пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, вследствие вместо одной АК кодируется другая либо образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из АК(нонсенс мутации). Мутации со вставками или выпадением 1 пары азотистых оснований ведут к изменению всех последующих кодонов- мутации со сдвигом считывания. У микроорганизма, несущего точковую мутацию в 1 гене может возникнуть вторичная мутация в этом же гене, в результате произойдет восстановление дикого фенотипа, при этом первичную мутацию называют прямой, а вторичную- обратной.При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, но и генотип. Восстановление одного фенотипа может произойти в результате супрессии т.е. подавления мутанного фенотипа, который выражается в исправлении мутационного изменения. При внегенной супрессии вторичные мутации, подавляющие выражение первичного мутационного изменения, локализованы в генах- супрессорах, кодирующих синтез т-РНК Хромосомные мутации –крупные перестройки в отдельных фрагментах ДНК, возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов(делеция), либо поворота участка ДНК на 180 град. (инверсия), либо повторение фрагмента ДНК(дупликация). Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением Is-последовательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон.По фенотипическим последствиям делят на: нейтральные, условно-летальные, летальные Нейтральные - фенотипически не проявляются изменением признаков, поскольку они заметно заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента. Условно-летальные - приводят к изменению, но не к утрате функциональной активности фермента. Летальные- полная утрата способности синтезировать жизненоважные ферменты. Чаще всего возникают при обширных делециях, захватывающих группу генов. В фенотипе проявляются в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков(жгутиков, пилей. Капсул, способности ферментировать углеводы. Синтезировать АК, витамины. Мутанты, нуждающиеся в определенных АК, азотистых основаниях назыв. Аукострофными.К мутагенам относят химические в-ва или физические факторы(УФ- лучи, радиация), вызывающие предмутационные повреждения в отдельном фрагменте ДНК, которые переходят в мутацию в результате ошибок в работе реперирующих ферментов или в процессе репарации. Действие одних приводит к изменениям первичной структуры ДНК, путем замены пар оснований. При воздействии азотистой кислоты, вызывающей дезаминирование азотстых оснований, цитозин превращается в урацил, а аденин в гипоксантин. Другие мутагены, например акридиновые красители, непосредственно комплексируются с ДНК, вызывая выпадение или вставки оснований. Третьи мутагены-нитрозосодержащие, обладают множественным эффектом, вызывая при этом высокую частоту мутаций, за что получили название супермутагенов. Из физических факторов для индукции мутаций чаще всего используют УФ- облучение, которое приводит к образованию тиминовых димеров в ДНК, т.е. прочных связей между соседними тиминами в одной цепи, которые препятствуют работе ДНК-азы, нарушая процесс репликации ДНК. Мтагены не обладают специфическим действием, так как они могут вызвать изменения в любом гене, содержащемся в геноме микробной клетки. Некоторые химиотерапевтические препараты также обладают мутагенным действием. А\Б не являются мутагенными, однако при воздействии на метаболизм НК бактерий некоторые могут вызывать предмутационные повреждения. Клеточный геном (ДНК) не является пассивной мишенью, подвергаемой действию мутагенных факторов, они обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала. Эти сис-мы – репарационные, а сам процесс восстановления клеточного генома- репарации. Способность бактериальных клеток к репарациям обусловливает относительную стабильность их ДНК. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами, образование которых контролируется специальными генами. Ф-и ферментов- установление места повреждения ДНК, его вырезание, синтез поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК. Одна из систем, восстанавливающая повреждения ДНК, вызванные УФ- лучами названа сис-мой фотореактивации. Ферменты действуют в присутствии видимого света и осуществляют расщепление тиминовых димеров, превращающей их мономерные формы. Активность другой системы обеспечивается ферментами, действующими в отсутствии видимиги света- сис-ма темновой репарации, которую делят на дорепликативную и пострепликативную.Процесс дорепликативной репарации: 1. Обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК эндонуклеазой; 2. Удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой Ι; 3. Синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити либо ДНК-полимеразой Ι, либо ДНК- полимеразой ΙΙΙ; 4.сшивание восстановительного фрагмента ДНК с основной нитью, осуществляемое лигазой.Мутанты, утратившие способность к темновой репарации репарируются сис-мой пострепликативной репарации путем рекомбинаций. SOS- репарация является индуцибельным процессом, который происходит при множественных изменениях в ДНК, она имеет несколько сис-м активации. Низкая и средняя сис-мы- происходят быстро, при высокой наблюдается разрушение хромосомы, амплификация плазмиди переход интегративной фаговой инфекции в продуктивную- происходит гибель клетки, но осуществляется спасение маркеров для бактериальной популяции. Репарирующие сис-мы способны восстанавливать повреждения клеточного генома, вызванного радиацией. Дефекты этих сис-м –причины ряда заболеваний.

24. Генетические рекомбинации к бактерий. Трансформация. Трансдукция. Конъюгация. Их роль в эволюции микроорганизмов.Генетические рекомбинации определяют способом размножения и закономерности передачи генетического материала. У клеток эукариот они осуществляются в ходе процессов, сопровождающих половое размножение путем реципрокного (взаимного) обмена фрагментами хромосом. При таком обмене из 2-х рекомбинирующих родительских хромосом образуются 2 рекомбинантные хромосомы. Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора. Последнее приводит к формированию неполной зиготы- мерозиготы., в которой образуется только один рекомбинатРекомбинации делят на законные и незаконные. Законная рекомбинация требует наличия протяженных, комплементарных участков ДНК в рекомбинируемых молекулах. Она происходит только между близкородственными видами микроорганизмов. Незаконная – не требует наличия протяженных, комплементарных участков ДНК, она происходит при участии IS-элементов, которые имеют «липкие концы», обеспечивающие их быстрое встраивание в бактериальную хромосому. Практическое значение имеют запрограммированные внутригеномные рекомбинации, при которых происходит только изменение локализации имеющихся генов, что играют важную роль в изменении антигенной структуры микроорганизмов, эффективно противостоят факторам иммунной системы. Генетические рекомбинации происходят за участием ряда ферментов. Существую специальные rec-гены, детермирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала(хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации, а плазмидных генов- путем трансдукции и конъюгации. Трансформация- непосредственная передача генетического материала донора реципиентной клетке. Впервые воспроизведена в опытах с авирулентным бескапсульным штаммом пневмококка, который приобрел вирулентные свойства. Феномен трансформации воспроизводится в опытах с разными патогенными и непатогенными бактериями: стрептококками, менингококками. С донорной ДНК в реципиентную клетку обычно передается только один ген, это связано с протяженностью трансформирующего фрагмента ДНК, который может проникнуть в реципиентную клетку(вкл. Один или несколько сцепленных генов). Эффективно трансформация происходит в опытах с бактериями одного и того же вида, имеющих разный генотип. Трансформирующему действию ДНК поддаются не все. А только част клеток бактериальной популяции.Клетки, способные воспринимать донорную ДНК- компетентные. Состояние компетентности возникает в определенный период роста бактериальной культуры, совпадающий с концом логарифмической фазы. В результате- клеточная стенка становится проницаемой для высокополимерных фрагментов ДНК. Это связано с тем, что трансформируемый фрагмент ДНК связывается с белком, образуя трансфосому, в которой он переносится в бактериальную клетку Фазы трансформации: 1. Адсорбция ДНК- донора на клетке- реципиенте.2. проникновение ДНК внутрь клетки- реципиента;3. Соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией. После проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализируется. Затем происходит физическое включение 2-х нитей ДНК донора в геном реципиента Трансдукция - передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов. Делят на неспецифическую, специфическую и абортивную трансдукции. Неспецифическая- происходит в процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК, когда может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактоерии- донора, при этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. При немпецифической трансдукции в клетке реципиентного штамма вместе с фаговой ДНК могут быть перенесены любые гены донора, например гены контролирующие способность синтезировать АК, пурины, пиримидины, гены резистентности к а/б.Таким образом при неспецифической трансдукции трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, так кА сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинатов. Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерий- донора к бактерии –реципиенту, это связано с тем, что образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии- реципиента. Абортивная трансдукция- при ней, принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии- донора не включается в хромосому бактерии- реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из 2-х дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачивается в потомстве. Конъюгация- перенос генетического материала из клетки- донора в клетку реципиента при их скрещивании. Донорами генетческого материала являются клетки, несущие F- плазмиду(половой фактор). Бактериальные клетки, не имеющие F- плазмиды, не способны быть генетическими донорами, они являются реципиентами генетического материала и обозначаются F¯ клетки. При скрещивании F¯ клетки с F⁺ половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой- все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся F¯ клетки. Важнейшим свойством F- плазмиды является способность включатся в определенные участки бактериальной хромосомы и становится ее частью. В некоторых случаях F- плазмида освобождается из хромосомы, захватывая при этом сцепленные с ней бактериальные гены. Первым этапом является прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок, затем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки- донора в клетку- реципиент могут передаваться F- фактор и др. плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии. Для переноса бактериальной хромосомы необходим разрыв одной из цепей ДНК, который происходит в месте включения F- плазмиды при участии эндонуклеазы, т.е. при конъюгации передается только одна нить ДНК-донора, а 2-я, оставшаяся комплементарная, цепь достраивается в реципиентной клетке.

25.Микробиологические основы генетической инженерии и биотехнологии. Конструирование геннно- инженерных штаммов с заданными свойствами, их использование в получении вакцин. Развитие молекулярной генетики стало мощным стимулом для исследований, посвященных изучению молекулярно-генетических основ патогенности и иммуногенности, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микрооранизмов, распространением антибиотико- резистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Достижения генной инженетии позволяют создать новые генетические элементы из нуклеотидных последовательностей, несущие заданную информацию, способы их переноса в клетки про- и эукариотов.Новые генетические элементы представляют собой рекомбинантные молекулы ДНК, которые включают 2 компонента: вектор- переносчик и клонированную «чужеродную» ДНК. Вектор должен обладать свойствами репликона и обеспечить репликацию вновь созданной рекомбинантной молекулы. Поэтому, в качестве вектора используют такие репликоны как плазмиды, умеренные фаги, вирусы животных, имеющие циркулярную замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК- фрагмент ДНК, несущий необходимый ген, контролирующий синтез нужного продукта. Сейчас разработаны различные технологические приемы создания рекомбинантных молекул, например- обработка выделенных молекул ДНК вектора и ДНК, несущей нужный ген, ферментами рестриктазами, атакующими взятые молекулы ДНК в строго определенном участке. Некоторые рестриктазы расщепляют молекулы ДНК сообразованием однонитевых комплементарных друг другу концов(липких концов).Этапы: 1. Разрезание молекулы ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции; 2. Обработка полученных линейных молекул ферментом полинуклещтидлигазой, которая сшивает 2 разные молекулы в одну рекомбинантную; 3. Введение рекомбинантных молекул методом трансформации в клетки Е.соΙİ.