Определение общего белка в сыворотке крови

Результаты опытов Таблица 3.

Группа осадителей	Реактивы	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция

5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, включая экспериментальные данные, таблицы и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

6.1. Какие уровни структурной организации белковой молекулы Вы знаете? Какие связи участвуют в их стабилизации?

6.2. Что такое денатурация белка? Какие уровни структурной организации при этом разрушаются?

6.3. Какие денатурирующие агенты Вам известны? Какие связи в молекуле белка они преимущественно разрушают?

6.4. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

6.5. Что понимают под обратимым и необратимым осаждением белков? Какие реакции осаждения белков являются обратимыми? Какие реакции осаждения белков необратимы?

6.6. Чем обусловлены необратимые реакции осаждения белков? Применение их в медицинской практике.

6.7. Будет ли коагулировать белок из раствора в присутствии избытка кислоты или щелочи? Почему?

6.8. Будет ли происходить осаждение белка при действии: 1) низких концентраций раствора хлорида натрия; 2) высоких концентраций раствора хлорида натрия; 3) низких концентраций раствора хлорида ртути?

6.9. Что такое высаливание белков? Для каких целей используется высаливание в медицине?

6.10. Чем обусловлен заряд белковой молекулы в растворе?

6.11. Дайте определение изоэлектрической точке белка. Как можно определить ИЭТ белка?

6.12. Определите направление движения белка с pI = 4,6 при фракционировании методом электрофореза в буферном растворе с рН = 8,2.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить общий белок в сыворотке крови 2. ЗАДАНИЕ 2.1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Содержание общего белка в сыворотке (плазме) крови можно характеризовать понятиями нормо-, гипо- и гиперпротеинемия, под которыми подразумеваются состояния, сопровождающиеся нормальной (не выходящей за пределы физиологических колебаний), пониженной или повышенной его концентрацией. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови составляет: у взрослых - 65-85 г/л, у новорожденных - 46-60 г/л, у детей до 2 лет – 51-75 г/л, старше 2 лет - 60-85 г/л.

Изменения уровня общего белка могут быть как абсолютными, так и относительными. Последние обычно отмечаются при увеличении (уменьшении) объема крови. Так, гидремия («водное» отравление), обильные вливания раствора глюкозы и других физиологических жидкостей, анурия, гиперсекреция антидиуретического гормона и альдостерона, которые способствуют задержке воды в организме, приводят к развитию относительной гипопротеинемии; при дегидратации (обезвоживании) вследствие потери жидкости при неукротимой рвоте, профузных поносах, холере, несахарном диабете, усиленном потоотделении (лихорадке), полиурии обнаруживается относительная гиперпротеинемия.

При подавляющем большинстве заболеваний внутренних органов, сопровождающихся сдвигами в белковом обмене, обнаруживается гипопротеинемия, носящая обычно вторичный, приобретенный характер (первичная гипопротеинемия встречается сравнительно редко, является генетически детерминированной и возникает вследствие дефектов генов, кодирующих определенные белки сыворотки, например – анальбуминения, агаммаглобулинемия и др.).

Абсолютная гипопротеинемия выявляется при патологических состояниях, при которых наблюдается снижение биосинтеза, усиление катаболизма или увеличение потерь белка. Наиболее частыми причинами ее являются:

1. Недостаточное поступление белка с пищей, наблюдаемое обычно при недоедании, голодании, опухолях, сужении пищевода, нарушении функции желудочно-кишечного тракта (вследствие ухудшения переваривания и всасывания белковых компонентов пищевых продуктов), при продолжительных воспалительных процессах в кишечнике. По мнению А.А. Покровского, даже несбалансированный аминокислотный состав пищи может иногда приводить к гипопротеинемии.

2. Подавление протеосинтетической функции печени, наблюдаемое при паренхиматозных гепатитах, а также интоксикациях, обусловленных длительными нагноительными процессами, злокачественными новообразованиями, действием некоторых химических ядов. Пораженные печеночные клетки, являющиеся местом образования альбуминов, фибриногена и части глобулинов, не в состоянии синтезировать белки плазмы крови в достаточном количестве, вследствие чего развивается гипопротеинемия, обусловленная в основном гипоальбуминемией и гипофибриногенемией.

3. Повышение распада белка в организме, вызванные потребностью в возмещении больших энергетических затрат, связанных с дефицитом пластических ресурсов (ожоговая болезнь, злокачественные новообразования, гипертиреоидизм, гиперкортицизм и т.д.).

4. Потеря белка организмом с кровью при острых и хронических кровотечениях, с мочой при нефротическом синдроме, через поврежденную слизистую кишечника (энтеропатии) и кожу (псориаз, обширные ожоги и др.).

Пониженное содержание белка в плазме крови отмечается и при некоторых физиологических состояниях, например, у женщин в последние месяцы беременности и в период лактации.

Следует отметить, что для обеспечения нормальных процессов жизнедеятельности организм при гипопротеинемии утилизирует прежде всего альбуминовую фракцию белков плазмы крови. При усиленном расходовании альбуминов, обусловливающих в основном онкотическое давление крови, развиваются отеки, которые отмечаются при патологических состояниях, сопровождающихся уменьшением содержания белка в плазме крови ниже 50 г/л. Также хорошо известно, что половина кальция плазмы крови связана с альбумином. Поэтому гипоальбуминемия почти всегда сопровождается гипокальциемией. При этом происходит уменьшение только связанной с белком (физиологически неактивной) фракции кальция, что не приводит к развитию тетании и судорог. Одной из важных функций альбумина является связывание и транспортировка билирубина, свободных жирных кислот и многих лекарственных препаратов (например салицилатов, пенициллина и сульфаниламидов). Связанные с альбумином лекарственные вещества физиологически и фармакологически не активны. Значительное уменьшение альбумина плазмы, приводя к снижению связывающей способности, может повысить уровень свободных фракций указанных выше веществ, результатом чего могут быть токсические эффекты при обычных дозировках лекарственных препаратов.

Абсолютная гиперпротеинемия - явление сравнительно редкое. Обычно она вызывается усилением биосинтеза глобулинов в клеточных элементах системы фагоцитирующих мононуклеаров (вследствие их инфекционного или токсического раздражения) при длительно текущих хронических воспалительных процессах. Это наблюдается, в частности, при хроническом полиартрите, циррозах печени и некоторых хронических процессах.

Значительная и стойкая гиперпротеинемия - до 120 г/л и выше фиксируется при миеломной болезни (плазмоцитоме), макроглобулинемии Вальденштрема, в результате которых в плоских костях черепа появляются дополнительные очаги образования "ненормальных" или патологических белков - парапротеинов. Поэтому, если у больного обнаружено высокое содержание общего белка в плазме крови, его нужно дополнительно обследовать на выявление этих форм аномальных белков.

Обнаружение аномальных белков в сыворотке крови (парапротеинемия) чаще всего наблюдается при патологических состояниях, в основе генеза которых лежат злокачественные новообразования: миеломатоз, на долю которого приходится большинство случаев злокачественных парапротеинемий; В-клеточные лимфомы, в том числе хронические лимфолейкозы; заболевания, связанные с аномалиями тяжелых цепей иммуноглобулинов, к которым относят редко встречающуюся группу заболеваний, характеризующихся накоплением в плазме крови или моче аномального белка, идентифицируемого с фрагментом Н-цепи. К группе парапротеинемий относится и криоглобулинемия, при которой в плазме крови больных выявляется присутствие криоглобулинов, к которым относят белки, выпадающие в осадок при охлаждении проб плазмы крови ниже температуры тела человека. Иногда, особенно если концентрация белка высока, внутрисосудистая преципитация может вызвать такие поражения кожи, как пурпура или феномен Рейно.

Из сказанного выше следует, что гипопротеинемия почти всегда связана с гипоальбуминемией, а гиперпротеинемия - с гиперглобулинемией.

При многих заболеваниях часто изменяется процентное соотношение отдельных белковых фракций, хотя общее количество белка в сыворотке крови остается в пределах нормы. Такое состояние носит название диспротеинемии. Так например, благодаря относительно небольшой молекулярной массе, потери значительных количеств альбумина происходят при условиях, для которых характерно повышение проницаемости биологических мембран, отделяющих плазму крови от межклеточной жидкости. Поэтому при воспалительной реакции организма на повреждение, вследствие увеличения проницаемости сосудистой стенки, происходит «выпотевание» альбуминов в интерстициальную жидкость, что приводит к снижению его концентрации в плазме крови - гипоальбуминемии. Однако при этом в плазме крови резко возрастает доля глобулиновых фракций (прежде всего a-глобулинов, которые включают в свой состав белки-реактанты острой фазы, или g-глобулинов), что как правило не приводит к изменению концентрации общего белка сыворотки. В то же время отмечается резкое изменение соотношения различных белковых фракций плазмы крови.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ 4.1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Известные в настоящее время методы количественного определения белков сыворотки крови можно подразделить на колориметрические, основывающиеся на цветных реакциях белков с определенными реактивами; спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени светопоглощения в ультрафиолетовой области и другие. Из колориметрических методов особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции. Они являются весьма точными, практически доступными и основаны на способности белков реагировать в щелочной среде с сернокислой медью, образуя комплексные соединения фиолетового цвета. При этом различия в интенсивности окрашивания комплексов, образованных альбуминами и глобулинами незначительно, что позволяет использовать данный метод для выявления уровня практически всех белков сыворотки крови.

Ход работы

К 5 мл рабочего раствора биуретового реактива добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Через 30 минут пробу колориметрируют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре (длина волны 546 нм) против контроля, который готовят путем прибавления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл 0,9% NaCI. Расчет ведут по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. Из 10% стандартного раствора белка в 0,9% растворе NaCI готовят рабочие стандартные растворы так, как указано в таблице 10 (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5 мл биуретового реактива. Через 30-60 минут измеряют экстинкцию стандартных проб на ФЭКе против контроля.

Средние значения оптической плотности, соответствующие различным концентрациям, наносят на миллиметровую бумагу. На оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка, на оси ординат - соответствующие им величины оптической плотности. Через полученные точки проводят прямую линию.

Данные для построения калибровочного графика для количественного определения концентрации общего белка в сыворотке крови представлены в таблице 4.

Данные для построения калибровочного графика Таблица 4