Молекулярная природа наследственных заболеваний и современные подходы к их лечению

Глава 4

МЕДИЦИНСКИЕ АСПЕКТЫ БИОИНФОРМАТИКИ

Молекулярная природа наследственных заболеваний и современные подходы к их лечению

Классификация моногенных и мультифакторных заболеваний человека и их молекулярная основа. Здоровье и предрасположенность к различным заболеваниям в значительной мере зависит от генетических особенностей человека. В бывшем Советском Союзе развитие медицинской генетики связано с именем академика Н.П.Бочкова, создателя Института медицинской генетики АМН СССР (ныне Медико-генетический научный центр РАМН: см. Интернет сайт этого учреждения [1]). Его перу принадлежит целый ряд книг по различным проблемам наследственных и врожденных заболеваний, в том числе учебник [2]. Успешное завершение международного проекта «Геном человека», о котором мы говорили в предыдущей главе, расшифровка структуры генома человека и целого ряда других организмов открыли недоступные ранее возможности для понимания молекулярных основ наследственных болезней, разработки новых стратегий диагностики и лечения. Вопросам молекулярно-генетических механизмов наследственных заболеваний, а также методам развития молекулярной диагностики и генотерапии посвящены, в частности, книги [3,4]. На эти три труда мы и будем опираться в значительной части дальнейшего изложения.

Рис. 4.1. Количество генов, вовлеченных в развитие и функционирование органов и тканей человека (взято из [5]).

На рис. 4.1 показано то огромное количество генов, которое вовлечено в развитие и функционирование органов и тканей человека. Неполадки в каждом из них могут привести к тяжелым, иногда смертельным наследственным заболеваниям (hereditary diseases). В настоящее время известно 5 тысяч наследственных заболеваний, из них 2 тысячи представляют тяжелые расстройства, приводящие к инвалидности. Подробности о многих заболеваниях и их молекулярно-генетических особенностях можно найти в разделе «Генетика» [6] Базы знаний по биологии человека HUMBIO [7], которая создана и поддерживается в Институте молекулярной генетики РАН.

До недавнего времени были изучены главным образом моногенные болезни, т.е. возникающие при нарушении работы одного гена. Их сегодня известно более тысячи – от них в общей сложности страдает около 5% новорожденных. Однако большинство наследственных болезней связаны с одновременным нарушением работы нескольких генов и определенными воздействиями внешней среды – их называют мультифакторными болезнями. В той или иной мере наследственные особенности определяют восприимчивость или устойчивость к большинству заболеваний, в том числе и к инфекционным. Поэтому, фактически, здоровье или болезнь – это результат взаимодействия наследственных задатков и среды.

Геномные исследования позволяют выявлять предрасположенность к ряду патологий на любой стадии развития организма, что расширяет объем пресимптоматической, дородовой и преимплантационной (предшествующей внедрению зародыша в матку) диагностики. Для этого проводится анализ ДНК, получаемой обычно из крови или других биологических образцов индивида.

Наследственные заболевания обусловлены хромосомными перестройками или генными мутациями. У человека различают наследственные заболевания с полным проявлением мутации (все хромосомные и некоторые генные) – синдром Дауна, гемофилия А, В, С, фенилкетонурия и др.; с неполным(зависящим от условий среды) проявлением мутаций – некоторые формы диабета, подагра и др.; возникающие из-за внешних факторов, но обусловленные генетической предрасположенностью к ним – аллергия, атеросклероз, рахит и др. Среди генных наследственных заболеваний выделяют моногенные и полигенные (мультифакторные), а среди моногенных различают формы с разным типом наследования (аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные, доминантные и рецессивные сцепленные с полом). Доля наследственных заболеваний составляет около 10% всех заболеваний человека.

Хромосомные болезни – это группа болезней, в основе развития которых лежат нарушения числа или структуры хромосом, возникающие в гаметах родителей или на ранних стадиях дробления зиготы. История изучения хромосомных болезней берет начало с клинических исследований, проводившихся задолго до описания хромосом человека и открытия хромосомных аномалий. В частности, к ним относятся болезнь Дауна (трисомия 21), синдромы Тернера (Х0-синдром), Клайнфельтера (XXY-синдром), Патау (трисомия 13), Эдвардса (трисомия 18). В настоящее время описано 2 варианта нарушений числа хромосомных наборов - тетраплоидия и триплодия. Другая группа синдромов обусловлена нарушениями числа отдельных хромосом – трисомиями (когда имеется добавочная хромосома в диплоидном наборе) или моносомиями (одна из хромосом отсутствует). Моносомии аутосом несовместимы с жизнью. Трисомии – более часто встречающаяся паталогия у человека. Ряд хромосомных болезней связан с нарушением числа половых хромосом. Самая многочисленная группа хромосомных болезней – это синдромы, обусловленные структурными перестройками хромосом. Выделяют хромосомные синдромы так называемых частичных моносомий (увеличение или уменьшение числа отдельных хромосом не на целую хромосому, а на ее часть).

Моногенные заболевания. Рассмотрим некоторые наиболее часто встречающиеся моногенные болезни, т.е. болезни, возникающие в результате нарушения работы одного гена [8]. При фенилкетонурии мутации нарушают работу гена, контролирующего превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. Болезнь развивается, когда ребенок получает поврежденный ген от обоих родителей. Если один из пары генов нормален, человек остается здоровым. Сегодня частота появления фенилкетонурии (т.е. мутаций в обеих копиях гена) составляет 1 на 10–17 тыс. рождений, а частота скрытого носительства болезнетворного аллеля – 1 на 100. Поскольку эта патология встречается достаточно часто, всех новорожденных тестируют на фенилкетонурию. Вовремя назначенная специальная диета может предотвратить болезнь или облегчить ее течение. У каждого народа свой спектр характерных мутаций. Например, в Волго-Уральском регионе России фенилкетонурия особенно часто встречается среди русских. Большинство случаев заболевания вызвано одной и той же мутацией, принесенной сюда переселенцами из Северной Европы. В семьях других национальностей фенилкетонурия вызывается несколькими различными мутациями.

При аутосомно-рецессивном заболевании – болезни Вильсона-Коновалова из-за мутаций в гене, связанном с обменом меди, в организме накапливается медь. В результате ее токсического действия поражаются печень и головной мозг. Заболевание долгое время протекает скрыто, ранние проявления весьма многообразны, что затрудняет его выявление. Болезнью Вильсона-Коновалова страдают во всем мире, причем некоторые народы особенно часто. Так, у евреев-ашкенази ее частота в 30 раз превышает среднемировую. В настоящее время известно более 70 различных мутаций, приводящих к этой патологии. В некоторых этнических группах, наряду с широко известными, можно обнаружить “молодые” мутации, свойственные только им. Например, у представителей татарской национальности выявлена мутация, которая нигде больше не встречается. Молекулярно-генетический анализ позволил предположить ее тюркские корни.

Этнические особенности обнаружены в спектре и частоте мутаций для такой тяжелой патологии, как муковисцидоз. У представителей белой расы – это одно из самых распространенных моногенных заболеваний. Изменения в гене белка, участвующего в переносе ионов хлора через клеточную мембрану, приводят к нарушению секреции эндокринных желез с поражением дыхательного и желудочно-кишечного трактов. В Башкортостане выявлено девять связанных с муковисцидозом мутаций, а всего в мире их описано более тысячи. В Волжско-Уральском регионе “европейская” мутация найдена у русских и татар, а “тюркская” - у татар и башкир.

Большинство моногенных мутаций проявляется на самых ранних этапах развития – в детстве или даже во внутриутробном периоде. При болезнях плода чаще всего нарушается работа белков, регулирующих одновременно множество генов (факторов транскрипции). На первом году жизни наиболее часты нарушения, связанные с обменом веществ. Однако некоторые генетические дефекты могут не проявляться до глубокой старости. Например, в генах белков пресениллинов (PS) найдены мутации, приводящие к болезни Альцгеймера - одной из форм старческого слабоумия. А встраивание избыточных тринуклеотидных повторов в “гентингтон”-ген связано с другой болезнью, также проявляющейся в преклонном возрасте, – хореей Гентингтона.

Мультифакторные заболевания. К мульти(много)факторным, или полигенным заболеваниям относятся болезни, развитие которых зависит от взаимодействия множества факторов – наследственных и средовых (см. рис. 4.2). В этой группе заболеваний можно указать такие болезни, вызванные пороками развития, как сахарный диабет, ишемическую болезнь сердца, эссенциальную гипертензию, язвенную болезнь, бронхиальную астму. Сейчас к мультифакторным наследственным заболеваниям относят даже алкогольный психоз и наркоманию. Уже известны некоторые гены, обусловливающие предрасположенность к таким заболеваниям. Патогенные мутации в этих генах не обязательно приводят к заболеванию, но риск его развития повышен. При этом соотношение влияния наследственных ("гены риска") и внешних факторов у больных неодинаково. Например, хотя для ишемической болезни сердца характерна сложная этиология, примерно 5% больных с ранним инфарктом миокарда гетерозиготны по мутации гена, вызывающей семейную гиперхолестеринемию – моногенную болезнь, проявляющуюся в развитии атеросклероза даже в отсутствие неблагоприятных внешних факторов. Однако на проявления семейной гиперхолестеринемии влияют другие гены, например ген апопротеина В, ген апопротеина (а), ген липопротеидлипазы и ген апопротеина Е, а также внешние факторы: режим питания или курение. Риск заболевания зависит от множества наследственных и внешних факторов.

Рис. 4.2. Факторы развития мультифакторных заболеваний.

Как мы видим, предрасположенность к мультифакторным болезням возникает тогда, когда нарушена регуляция различных систем: нейроэндокриных, иммунны х, обмена веществ, в том числе обезвреживания чужеродных веществ (так называемых систем трансформации–детоксикации ксенобиотиков). Отметим, что в организме ксенобиотики разлагаются в два этапа: сначала подвергаются ферментативной модификации, а лишь затем промежуточные метаболиты превращаются в растворимые безвредные соединения и выводятся. При этом промежуточные метаболиты могут отличаться более высокой мутагенной и онкогенной активностью, чем сами ксенобиотики или конечные продукты их разложения.

Различные варианты генов, кодирующих ферменты системы детоксикации, определяют скорость их работы. В частности, при сниженной активности детоксификационной функции плаценты (фермента плацентарной глютатион-метионинтрансферазы, GSTM1) возрастает риск ранних спонтанных абортов. Генетически детерминированная активность глютатионтрансфераз влияет и на развитие различных форм рака. Например, сочетание определенных мутаций увеличивает риск рака груди у женщин в 3–10 раз, а у курильщиц – в 40 раз.

В связи с этих необходимо отметить, что в лаборатории моделирования генетических процессов Института генетики и цитологии НАН Беларуси к.б.н. Э.В.Крупновой и к.б.н. Н.Н.Чаковой в рамках заданий ГКПНИ «Биологическая инженерия и биобезопасность» и ГП «Биотехнология» ведется паспортизация по молекулярному маркеру GST в целях диагностики наследственной предрасположенности к заболеваниям органов дыхания.

Заболеваемость органов дыхания различного происхождения среди взрослого и детского населения неуклонно возрастает во всем мире. Данная патология является лидирующей:

· по количеству дней нетрудоспособности;

· инвалидности;

· смертности (четвертое-пятое место)

Анализ полиморфизма GST-генов осуществлялся с использованием метода мультиплексной ПЦР. Гомозиготность по «нулевым аллелям» генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов амплификации размером 480 и 215 п.н. соответственно.

В результате, при изучении полиморфизма GST-генов у больных так называемым немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) в белорусской популяции было выявлено:

· частота встречаемости нулевых генотипов GSTM1(-) и GSTT1(-) составляет 36,7% и 26,7% соответственно;

· генотип GSTT1(-) в группе некурящих больных встречался со статистической достоверностью в 1,5 раза чаще (36,4%), чем среди курящих пациентов (23,7%).

Совместно с генетиками Республиканского научно-практического центра «Мать и дитя» начато изучение полиморфизма GST-генов у детей Беларуси с целью разработки технологии выявления наследственной предрасположенности к заболеваниям органов дыхания различной этиологии. Планируется провести анализ делеционного полиморфизма в генах системы детоксикации у новорожденных, у детей, страдающих бронхиальной астмой, у детей с хроническим обструктивным бронхитом, а также у здоровых детей того же возраста и определить частоту встречаемости нулевого генотипа в этих когортах.

Эффективность лечения различными препаратами также связана с состоянием генов. Так, при лечении эндометриоза (заболевания, встречающегося почти у 10% женщин белой расы) широко используется препарат циклоферон, который у части больных не вызывает положительных сдвигов по причинам генетического характера. Наши исследования также дадут возможность прогнозирования чувствительности пациентов к лекарственным препаратам различных фармакологических групп, в метаболизме которых участвуют глутатион-S-трансферазы, что позволит индивидуализировать медикаментозную терапию и снизить риск побочных эффектов.

К настоящему времени на хромосомах человека картировано около 800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболеваний, для которых известна локализация контролирующего гена, еще больше и приближается к 950 за счет существования аллельных серий, то есть групп болезней, клинически сильно отличающихся друг от друга, но обусловленных мутациями в одном и том же гене. Среди них гены, орбусловливающие предрасположенность к остеопорозу (VDR-3), дефектам заращения нервной трубки (ДЗНТ), коронарной болезни сердца (КБС) и атеросклерозу (MTHFR), инфаркту миокарда (АСЕ), атеросклерозу (АроЕ), аденоме и раку простаты (AR), диабету (IDDM-1 и -5), астме (СС16) и др. Известны также онкогены (Ras, Miс) и антионкогены (p53), мутации которых с большой вероятностью ведут к различным опухолям. Уже идентифицированы гены, мутации которых не только предрасполагают, но и с большой вероятностью вызывают серьезные заболевания (BRCA1, BRCA2 - рак молочной железы, PS-1, PS-2 - болезнь Альцгеймера и др.). Быстро увеличивается и список наследственных болезней с поздней манифестацией, для которых вполне реальна ранняя досимптоматическая диагностика в любом возрасте (хорея Гентингтона, другие нейродегенеративные заболевания, рак толстой кишки, щитовидной железы и др.).

Наконец, уже сегодня можно выявлять гетерозиготное носительство наиболее частых смертельных наследственных болезней в семьях высокого риска (муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, фенилкетонурия, синдром Мартина-Белла, гемофилия, спинальная мышечная атрофия, адреногенитальный синдром: см. таблицу 1 в работе [8]). Очень важно, что эти и многие другие тяжелые наследственные недуги с успехом диагностируются еще пренатально, что позволяет выявить возможность рождение больных детей.

Митохондриальные заболевания человека. В настоящее время в литературе можно найти сведения о более чем 100 точковых мутаций и несколько сотнях структурных перестроек митохондриальной ДНК (мтДНК), которые связаны с различными митохондриальными синдромами – от летальных в неонатальном периоде жизни до заболеваний с поздним началом. Непосредственная причина возникновения и развития митохондриальных расстройств кроется в дефектах системы окислительного фосфорилирования. Благодаря выявлению все большего количества пациентов и описанию сотен родословных составлена следующая классификация патогенных мутаций мтДНК (цитируется по [9]):

· Смысловые мутации в структурных генах. Наиболее типичным заболеванием, ассоциированным со смысловыми заменами в митохондриальном геноме, является наследуемая по женской линии нейропатия (атрофия) зрительных нервов Лебера (LHON).

· Мутации мтДНК, приводящие к нарушениям синтеза белка. Прогрессирующая с возрастом нейросенсорная глухота, если она наследуется по линии матери, часто ассоциируется с заменой А на Г в позиции 1555 гена 12S рРНК.

· Структурные перестройки мтДНК. Описано множество перестроек в мтДНК (дупликации, делеции или их комбинации), приводящих к нарушениям в системе окислительного фосфорилирования. Такие перестройки обнаружены у больных нейромышечными заболеваниями типа синдрома Кернса-Сейра (KSS), при прогрессирующей наружной офтальмоплегии (СРЕО) и синдроме Пирсона (болезнь костного мозга и поджелудочной железы).

· Взаимодействие двух геномов. Хотя большинство генов, продукты которых ответственны за нормальное функционирование системы окислительного фосфорилирования, располагаются в хромосомах, на сегодня известно всего несколько локусов, мутации в которых могут рассматриваться в качестве причины митохондриальной болезни. В качестве примера можно сослаться на синдром нейрогастроинтестинальной энцефалопатии (MNGIE), обусловленной мутацией гена тимодинфосфорилазы. Кроме того, в основе возникновения некоторых митохондриальных миопатий, таких как офтальмоплегия и птоз, может лежать дестабилизация молекулы мтДНК, инициируемая мутациями в ядерных генах.

Рис. 4.3. Карта мтДНК человека с указанием положения генов и относительно часто встречающихся патогенных мутаций (согласно [9]).

В лаборатории нехромосомной наследственности Института генетики и цитологии НАН Беларуси под руководством чл.-корр. НАНБ О.Г.Давыденко и к.б.н. Н.Г.Даниленко в содружестве с РНПЦ «Мать и дитя» ведется разработка методов ДНК-диагностики митохондриальных заболеваний человека, в частности вышеупомянутого синдрома Лебера. Изучается также генетическая предрасположенность белорусов к сердечно-сосудистым заболеваниям, ведется анализ генотипического риска в белорусской популяции по ключевым белкам липидного метаболизма и т.д. Успешно выполнен инновационный проект по геногеографии белорусов на основе анализа митохондриальной ДНК и Y-хромосомы.

Принципы молекулярной диагностики наследственных и ненаследственных заболеваний человека на разных этапах онтогенеза. В результате изучения генома человека появилась молекулярная медицина, одно из направлений которой – генная диагностика болезней, их профилактика и генотерапия, что имеет большое медицинское и социальное значение [10]. Сегодня вполне реальна не только пренатальная диагностика наследственных болезней, но и их досимптоматическая диагностика. Выявление гетерозиготного носительства мутаций в семьях высокого риска стало важным разделом медико-генетической службы.

Рис. 4.4. Примерное распределение генов человека по их функциям [5].

В России такие исследования проводятся во многих государственных и коммерческих центрах, в Беларуси лидером в этом направлении является РНПЦ «Мать и дитя», предшественником которого по части медицинской генетики был НИИ наследственных и врожденных заболеваний Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Этот институт был создан чл.-корр. РАМН и НАНБ Г.И.Лазюком и многие годы входил в число лучших медико-генетических учреждений Европы.

Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней. В общем случае использование прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предварительное генотипирование мутантных аллелей у родителей.

В случае прямой диагностики объектом молекулярного анализа является сам ген, точнее, мутации этого гена. Такой подход особенно эффективен при наличии точной информации о природе, частоте и локализации наиболее распространенных (доминирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также о наличии в них особенно легко мутирующих «горячих» точек. Главное преимущество прямого метода – это высокая, доходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на предмет ее информативности. Последнее обстоятельство особенно важно для проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисцидоза, миодистрофии Дюшена, гемофилии А и др.).

Однако существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны. Кроме того, всегда сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвестных мутаций. Далеко не всегда возможно применение такого подхода и в силу очевидных финансовых и временных ограничений. Эти трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диагностики.

Этот исторически более ранний подход основан на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых проводится идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших родственников.

В настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики принципиально возможны для выявления практически всех моногенных заболеваний с известной локализацией контролирующего гена, для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров. Косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мутации не известны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству.

В качестве еще одного примера работы белорусских исследователей следует назвать лабораторию молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси, где под руководством академика НАНБ Н.А.Картеля многие годы ведутся исследования молекулярных механизмов возникновения и развития рака щитовидной железы. В 2006 г. его учеником Д.Г.Ярмолинским защищена кандидатская диссертация на тему «Молекулярно-генетический анализ генома опухолевых клеток щитовидной железы у белорусских пациентов», в которой изучены молекулярно-генетические аспекты развития папиллярных карцином щитовидной железы, удаленных в период с 1996 по 2001 гг. у пациентов, которые проживали в белорусской зоне радиационного облучения во время аварии на Чернобыльской АЭС.

Генная и клеточная терапия моногенных и мультифакторных заболеваний [11]. Согласно мировой медицинской статистике, каждый сотый ребенок рождается с серьезным наследственным дефектом, причем количество таких дефектов постоянно растет. Трудно сказать, вызвано ли это объективными экологическими причинами или влиянием субъективных факторов, таких как улучшение качества диагностики, в том числе молекулярно-генетического анализа, но факт налицо. При этом нарушения в наследственном аппарате, особенно в гомозиготном состоянии, приводят к физическим или умственным отклонениям и преждевременной смерти. Положение осложняется тем, что для большинства из известных наследственных заболеваний не найдено достаточно эффективных традиционных способов лечения. Поэтому генная и клеточная терапия, т.е. введение в организм больного неповрежденной копии мутантного гена (или участка его ДНК), рассматриваются в настоящее время чуть ли не как панацея.

Первая успешная попытка применения генотерапии в клинической практике была осуществлена в США в 1990 г. Тогда ребенку с редким заболеванием (тяжелым комбинированным иммунодефицитом), которое связано с дефектом гена, кодирующего фермент аденозиндезаминазу, в организм была введена неповрежденная копия гена. Так была открыта новая эра в медицине.

В литературе описаны несколько подходов к генной и клеточной терапии. Гены можно вводить в половые клетки, в клетки эмбриона на ранних стадиях развития, а также в соматические клетки. По этическим причинам введение генов в половые клетки неприемлемо, так как такое изменение генотипа будет передаваться из поколения в поколение, что означало бы искусственное улучшение «породы человека» (в русле печально знаменитой евгеники). Основным подходом в генотерапии человека является использование соматических клеток пациента. При этом решающее значение приобретает правильный выбор типа соматических клеток, так как именно от этого зависит длительность сохранения и функционирования внесенного "лечебного" гена.

Таблица 4.1. Методы внесения ДНК в эукариотические клетки и область их применения (по [11]).

Методы переноса ДНК	Применимость для доставки генов
в культивируемые клетки	в ткани
Химические
Осаждение ДНК фосфатом Са	+	–
Физические
электропорация	+	–
микроинъекции	+	–
бомбардировка частицами	+	+
простая инъекция	–	+
Слияние
липосомы	+	+
Опосредованное рецепторами поглощение
ДНК-белковые комплексы	+	+
Рекомбинантные вирусы
аденовирусы	+	+
ретровирусы	+	–

Известны два метода генотерапии, соответствующие двум путям передачи пациенту "лечебного" гена: заместительная и корректирующая (или исправляющая) терапия. Первый способ применяется в случаях, когда болезнь связана с отсутствием или малыми количествами белкового продукта дефектного гена. Тогда достаточно ввести в клетку неповрежденный ген, который будет экспрессироваться и нарабатывать достаточные количества белка-продукта. Все используемые в настоящее время клинические методы переноса генов основаны именно на заместительной терапии. Корректирующая терапия во всех отношениях могла бы рассматриваться как идеальный способ излечивать генетические заболевания. В этом случае дефектный ген реально заменялся бы своей нормальной копией в результате рекомбинации двух молекул ДНК – поврежденной и нормальной. Однако пока этот метод не вышел за стены лабораторий и до его практического использования достаточно далеко. Даже в русскоязычном Интернете на него мало ссылок – большинство сайтов цитирует работу [11], на которую опираемся и мы в своем изложении.

Генетическую модификацию соматических клеток можно проводить непосредственно в организме больного. Однако чаще используется другой, более эффективный способ, когда функциональный ген вводится в предварительно выделенные и культивируемые клетки пациента, показывается его стабильная экспрессия, а уже только затем эти модифицированные клетки возвращаются обратно в организм.

Таблица 4.2. Генотерапия некоторых наследственных заболеваний (по [11]).

Заболевания	Тип вводимых генов	Тип клеток, в которые вводится «лечебный» ген
Тяжелый комбинирован-ный иммунодефицит	Ген аденозиндезаминазы	Т-лимфоциты, стволовые клетки костного мозга
Болезнь Гоше (лизосом-ная болезнь накопления)	Ген глюкоцеребозидазы	Стволовые клетки костного мозга
Семейная гиперхолисте-ринемия	Ген рецептора	Гепатоциты печени
Гемофилия	Ген одного из факторов свертывания крови	Фибробласты кожи
Талассемия	Ген глобулинов и их регуляторные участки	Клетки костного мозга
Муковисцидоз	Ген регулятора трансмем-бранной проводимости	Эпителий легкого (аэро-зольное впрыскивание вектора в дыхательные пути)
Прогрессирующая дист-рофия мышц Дюшена	Ген дистрофина	Мышцы (инъекции), миоциты

Когда «лечебный» ген вводился непосредственно в ткани пациента, в скобках указан способ его доставки. В остальных случаях введение гена производили в культуру клеток, извлеченных из организма больных.

Главная проблема в методе переноса генов – интегрируется ли новый ген в хромосому клетки-мишени. Одной из основных причин того, что в 80% случаев для внесения чужеродной ДНК при клинических испытаниях на людях использовали ретровирусные векторы, является их стабильная интеграция в клеточный геном, в отличие от аденовирусных векторов, которые в геном не интегрируются.

Молекулярная геномика. Использование методов молекулярной геномики позволит установить, какие гены дефектны у данного человека и какими заболеваниями это грозит. Уже сегодня в силах науки провести такой анализ и составить генетический паспорт человека. Эти достижения были бы невозможны без разработки соответствующего оборудования и программных продуктов, которые были созданы в ходе выполнения Международного проекта «Геном человека» и его составной части – Российского проекта «Геном человека». На рис. 4.5 с сайта Интернет-журнала «Коммерческая биотехнология» [12] видно, с каким воистину промышленным масштабом было развернуто секвенирование ДНК.

Рис. 4.5. Работы в США в рамках программы «Геном человека». Автоматизированная линия подготовки образцов ДНК для секвенирования в Центре геномных исследований института Уайтхеда (а). Лаборатория в Сэнгеровском институте, заполненная автоматами для высокопроизводительной расшифровки последовательностей ДНК (б).

Исследования в этом направлении ведутся и в России: в Москве - в Научном центре медицинской генетики и Институте неврологии РАМН, в Санкт-Петербурге – в Институте биорегуляции и геронтологии РАМН и в лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии РАМН, в Томске - в Институте медицинской генетики, в Медико-генетическом центре Новосибирска и в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Генетический анализ может выявить предрасположенность к гипертонии, диабету, некоторым формам рака, болезни Дауна, фенилкетонурии, к алкоголизму и наркомании, даже к гомосексуализму. Об особенностях молекулярной генетики наследственных заболеваний и проблемах, которые стоят перед ней как отраслью молекулярной медицины, можно прочитать в обзоре [13].

Рис. 4.6. Пример Интернет-сайтов российских центров молекулярной диагностики.

На рис. 4.6 приведены фрагменты Интернет-сайтов некоторых российских центров молекулярной диагностики, например [14]. С точки зрения медицинской биоинформатики такие сайты интересны тем, что на них собрано большое число статей и обзоров по проблемам генетики наследственных заболеваний, а также даются гиперссылки на другие информационные ресурсы по смежной тематике (например, по роли генов в развитии психических заболеваний – на сайт Научного центра психического здоровья РАМН [15]; по вопросам биобезопасности в применении генной и клеточной терапии – на Русский медицинский сервер [16] и т.д.). Кроме того, там можно проконсультироваться со специалистами в режиме он-лайн [17] или, как на сервере MedInternet [18], получить всю необходимую информацию: от каталога лекарственных препаратов и пищевых добавок до перечня медицинских учреждений России и справочника имен.

В плане «прорывных технологий», напрямую связанных с биоинформатикой, можно отметить проект группы компаний с участием “Motorola Life Sciences”, которые уже разрабатывают портативное устройство генной диагностики заболеваний на базе карманного компьютера. Оно будет определять болезнь, исследуя образец слюны пациента. Новая технология появится в лечебных учреждениях в течение ближайших пяти лет, а в быту – через десять лет.

Генная диагностика позволит определить наиболее слабые участки человеческого организма, предрасположенность к тем или иным болезням. Соответственно человек сможет построить свою жизнь так, чтобы в дальнейшем избежать проблем со здоровьем.

В случае, если генная диагностика выявит какое-то заболевание, лечить его будут с учетом индивидуальных особенностей организма конкретного человека. Сегодня для лечения используются массовые медицинские препараты, и на разных людей они действуют по-разному: из 100 человек у 60 могут произойти заметные улучшения в самочувствии, у 20 они будут незначительными, а еще 20 никак не почувствуют воздействие препарата. Благодаря молекулярной медицине в будущем будут созданы новые лекарства, гораздо более избирательные и эффективные, чем ныне существующие, поскольку они будут целенаправленно действовать на генные и белковые мишени.

Понятие о генетическом паспорте человека. В настоящее время технически уже доступен индивидуальный анализ по нескольким десяткам генов, т.е. каждый желающий знать свои генетические характеристики может получить генетический паспорт. Такой паспорт должен содержать информацию о наличии мутаций как в генах наследственных болезней, так и в генах предрасположенности к мультифакторным заболеваниям. Это своеобразный штрих-код, описывающий наличие тех или иных характеристик в ДНК индивида. В журнале «Природа» в 1999 г. появилась статья на тему генетического паспорта [19], которая стала своеобразным «бестселлером»: в Интернете можно найти более 500 ссылок на нее, в частности на сайтах Socioforum [20] и Geneforum [21].

Сейчас уже известно более 200 генов-маркеров: это "гены предрасположенности" к остеопорозу (VDR-3), дефектам заращения нервной трубки (ДЗНТ), коронарной болезни сердца (КБС) и атеросклерозу (MTHFR), инфаркту миокарда (АСЕ), атеросклерозу (АроЕ), аденоме и раку простаты (AR), диабету (IDDM-1 и -5), астме (СС16) и др.

В ряде западных стран генетическое тестирование проводят по медицинским показаниям или в качестве платной услуги. В США, например, введено генетическое тестирование военнослужащих не для медицинских целей. Его результаты, хранящиеся в специальной базе данных, позволяют идентифицировать человека гораздо точнее, чем надетый на руку жетон. Очень важен генетический паспорт для криминалистики. В тех же США решили пересмотреть дела, связанные с изнасилованием. Сравнили генетические паспорта осужденных и детей, которые родились у потерпевших, и оказалось, что 30% сидящих по этой статье не являются отцами данных детей.

Работы по генетической паспортизации уже получили финансовую поддержку в Ирландии, Финляндии, в некоторых штатах США. Большие средства на генетическое тестирование детей с семилетнего возраста выделены правительством Эстонии. Такие работы сопровождаются публикациями в средствах массовой информации, обсуждениями этических и социальных проблем и правовых аспектов. Не случайно в материалах Всемирной организации здравоохранения за 1998 г., посвященных этическим аспектам медицинской генетики, подчеркивается, что пресимптоматическое тестирование можно проводить только по желанию, только в случае возможной реальной пользы для пациента или его родственников, при условии максимально объективного информирования пациента о результатах тестирования.

Интересный факт приводят авторы работы [19]. При закрытом голосовании о целесообразности генетического паспорта из 57 отечественных специалистов-генетиков - участников школы по экологической генетике в Санкт-Петербурге (1998) – 47 дали положительный ответ, 3 – отрицательный и 7 –неопределенный. При этом, однако, большинство респондентов подчеркнули необходимость соблюдения строгой конфиденциальности и добровольности такой паспортизации. Однако, дискуссия, развернувшаяся в Интернете вокруг этой статьи сразу на нескольких сайтах (см., например [20–21]), показывает, что в целом люди еще не готовы к генетической паспортизации.

4.2. РНК-интерференция: теоретические и практические аспекты

Малые РНК как индукторы РНК-интерференции. Нобелевская премия в области медицины и физиологии за 2006 г. присуждена американским генетикам - 47-летнему профессору патологии и генетики Медицинской школы Стэнфордского университета Эндрю Файеру (Andrew Z. Fire) и 45-летнему профессору молекулярной медицины Медицинской школы Массачусетского университета в Вустере Крэйгу Меллоу (Craig C. Mello). Исследователи открыли и описали механизм универсального явления – «генной цензуры», или РНК-интерференции, при которой происходит избирательное подавление экспрессии генов, унаследованных организмом [22]. Это один из редких случаев, когда от начала работ, до их увенчания Нобелевской премией прошло чуть больше десяти лет.

Первые загадочные результаты были получены еще в 1980-х - начале 1990-х гг. Сначала в опытах на кишечной палочке было установлено, что искусственное введение в клетку синтетических фрагментов одноцепочечных молекул рибонуклеиновой кислоты может приводить к отключению генов. Затем на цветах (петуния) и червях (нематода Caenorhabditis elegans) введение в клетки дополнительных копий генов вместо усиления экспрессии наблюдался противоположный эффект: полное "замолкание".

В 1997 г. Э.Файер и К.Меллоу в экспериментах с нематодой Caenorhabditis elegans обнаружили, что РНК очень эффективно отключает гены, если ее вводить короткими фрагментами, причем не одноцепочечными, а двухцепочечными! Это наблюдение было сделано почти случайно – исследователи вовсе не предполагали, что такие фрагменты будут работать лучше одноцепочечных, они вводили их просто для контроля. Поначалу это явление казалось загадочным, т.к. двухцепочечная РНК сама по себе не может связаться с матричной, ей сначала надо расплестись на две нити. Первооткрыватели тоже не могли его объяснить, это удалось сделать лишь позже. Впервые об открытии было объявлено в феврале 1998 г., когда Э.Файер и К.Меллоу опубликовали в журнале «Nature» статью о новом явлении. Эффект "гашения" экспрессии определенных генов малыми РНК был назван К.Меллоу РНК-интерференция, а молекулы, вызывающие его, получили название siRNA (small interfering ribonucleic acids – малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты).

Структурно-функциональная организация и биогенез микро-РНК, коротких интерферирующих РНК и других малых РНК. В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до 300 нуклеотидов. За эффект РНК-интерференции отвечают самые короткие из них - siRNA, состоящие всего из 21-28 (у млекопитающих из 21-23) нуклеотидов (см. таблицу 4.3). Особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двунитчатыми. Нуклеотиды с противоположных нитей (цепей) siRNA спариваются друг с другом по тем же законам комплементарности, которые формируют двунитчатые цепи ДНК в хромосомах. Кроме того, по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Происхождение двухцепочечных РНК в клетке может быть различным: транскрипция с конаправленных промоторов, активность клеточной или вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, самокомплементарные транскрипты, способные к внутримолекулярному спариванию и образованию шпилечных структур, а также искусственно введённые в клетку молекулы [23].

Механизм РНК-интерференции очень древний. Скорее всего, биологическая эволюция создала его более миллиарда лет назад, когда нашу планету населяли одни лишь микроорганизмы. С его помощью они получили возможность защищаться от нападений вирусов. Позже эту способность у них переняли далекие потомки, грибки и растения, а потом и животные. Многоклеточные организмы также научились прицельно отключать с помощью РНК-интерференции свои собственные гены, прерывая процесс синтеза кодируемых ими белков.

В клетке существует специальный молекулярный механизм, который обеспечивает синтез siRNA, их накопление в клетке и последующиее выключение генов. Вот как он выглядит на схеме, приведенной на рис. 4.7.

Таблица 4.3. Основные типы малых РНК и их свойства (по [23]).

Класс	Подкласс	Длина (в нуклеотидах)	Биогенез	Механизм действия	Биологическая функция
Микро РНК (miRNA)	Нет	~22(19–25)	Двухстадийное разре-зание предшествен-ников шпилечных структур ферментами Drosha и Dicer	Репрессия транс-ляции, разрезание мРНК	Различные (часто действует в процессе развития и клеточной дифференцировки)
Короткая ин-терферирую-щая РНК (siRNAs)	Эндогенная взаимодей-ствующая siRNA	21–22 (у не-матоды) 21 (у расте-ний)	Разрезание длинных эндогенных dsRNAs с помощью Dicer	Разрезание мРНК	Неизвестна
Повтор-ас-социирован-ная siRNA (rasiRNA)	24–24 (у растений) 24–27 (у плодовой мушки)	Разрезание длинных dsRNAs, происходя-щих от повторяю-щихся последователь-ностей, ферментом Dicer	Модификация гис-тона и/или ДНК	Сайленсинг транспо-зонов, повторяющихся генов и вирусов
Малая ска-нирующая РНК (scnRNA)	~28	Разрезание длинных dsRNAs с помощью Dicer	Метилирование гистонов, ведущая к элиминации ДНК	Перестройка генома в ходе конъюгации
Крошечная некодирую-щая РНК (tncRNA)	Нет	~20	Производится фер-ментом Dicer из неизвестного пред-шественника	Неизвестен	Неизвестна
Малая моду-ляторная РНК (smRNA)	Нет	~20	Неизвестен	Транскрипционная трансактивация	Дифференциация ней-ронов

Рис. 4.7. Механизм работы siRNA в клетках растений и животных [24].

Первые 4 этапа являются общими для всех организмов. Сначала с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и нуклеаза (см. этап 1), формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения" гена).

Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся (этап 2). Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза – ее официальное название аргонавт (argonaute), может теперь связаться с комплементарным (строго соответствующим ей) участком однонитчатой мРНК (этап 3), позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие куски (этап 4).

У растений и насекомых существует своеобразный путь усиления защитного действия siRNA (этапы 5-7). Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью комплекса ферментов, называемого DICER, сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая таким образом разнообразные "вторичные" siRNA. Они, в свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полного уничтожения. Такие "вторичные" молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена "первичная" молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

У млекопитающих, в отличие от насекомых и растений, работает и другая система защиты. При попадании в "зрелую" (дифференцированную) клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 нуклеотидов, клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, способен стимулировать в клетке целую группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы во многом схожи. Даже названия «интерферон» и «РНК-интереференция» происходят от общего корня. Но есть у них одно важное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто «замораживает» работу клетки, останавливая производство сразу многих белков в клетке, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью – каждая молекула siRNA распознает и уничтожает только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции.

Функциональная роль РНК-интерференции. Итак, основная "специальность" siRNA в клетке - это блокирование тех генов, участок которых соответствует одной из цепочек внутри siRNA. Но зачем механизм РНК - интерференции существует в клетках? Какие процессы призван регулировать? Что из себя представляют те мРНК, на которые направлено жало малых РНК, и почему их необходимо уничтожать?

Одно из возможных объяснений роли РНК-интерференции - это защита организмов от РНК-содержащих вирусов и мобильных элементов, перемещающихся посредством РНК. Таким образом, двухцепочечная РНК (дцРНК) может быть важным звеном иммунной системы, распознающим и ликвидирующим чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК-содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, дцРНК будет мешать ему производить вирусные белки.

Как предполагают, роль коротких РНК в клетке не ограничивается только лишь защитой от вирусов и других чужеродных РНК. Они, оказывается, были созданы, чтобы защитить нас... от нас самих. Дело в том, что геном любого многоклеточного организма включает в себя множество элементов, которые когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например как результат встраивания вируса.

Из всего материала, содержащегося в хромосомах человека, 34% приходится на долю элементов, называемых LINEs и SINEs (соответственно, Long и Short Interspersed Nuclear Elements), о функциях которых известно только то, что они могут по временам копировать себя и перемещаться с одного места хромосомы на другое. Те участки ДНК, которые достались нам от ретровирусов (8% генома) и транспозоны (3%) также способны менять свое место в геноме. И только лишь 2% генов реально кодируют клеточные белки.

LINEs, SINEs, остатки вирусной ДНК и транспозоны, за свою способность к перемещениям именуемые подвижными, или мобильными элементами генома, представляют значительную опасность для наших хромосом. Некоторые из них - остатки вирусов, или протоонкогены - способны при "включении" вызывать рак; другие мобильные элементы, размножаясь и перемещаясь, меняют структуру хромосом, что может привести к мутациям.

Например, у плодовой мушки дрозофилы более 80% спонтанных мутаций возникают именно из-за "хулиганского" поведения ее собственных мобильных элементов. Их перемещения внутри генома так индивидуальны и непредсказуемы, что положение некоторых из них может служить "молекулярным паспортом", точно определяющим личность хозяина, что уже используется на практике.

Понятно, что каждому организму необходимо было разработать систему жесткого контроля за поведением мобильных элементов. Как раз эту "надзирательскую" функцию, как полагают, и выполняет система внутриклеточных siRNA. На модели все того же C. elegans, например, было показано, что отключение генов, кодирующих некоторые из малых РНК, ведет к активизации перемещений мобильных элементов в его хромосомах и, соответственно, к повышению уровня мутаций.

Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей при отключении генов, кодирующих систему siRNA у подопытных животных, а также ее активность в "незрелых" клетках указывают на то, что механизм РНК-интерференции активно участвует в регуляции программы "созревания" клеток и, как следствие, может играть одну из ключевых ролей в формировании целостного организма.

Еще одна из предполагаемых нормальных функций siRNA – отслеживание неправильно обработанных копий других типов РНК в клетке.

Наконец, в 2002 г. исследователи неожиданно выяснили, что действие siRNA может не ограничиваться только лишь временным выключением генов на уровне РНК. Имеются показания, что в некоторых случаях siRNA воздействует прямо на ДНК, изменяя структуру хроматина и способствуя длительному "замолканию" одних, и, возможно, активизации других генов.

Использование явления РНК-интерференции и малых РНК в функциональной геномике и экспериментальной генотерапии. Этот защитный механизм, предохраняющий клетку от вирусов и мобильных генетических элементов, можно использовать в терапевтических целях. Самое главное для практического применения РНК-интерференции – то, что для фермента аргонавт не имеет значения, какую информационную РНК (иРНК) уничтожать, он слепо следует указаниям микро-РНК.

Обычные лекарства действуют на уровне конечных стадий биохимического цикла, выключая синтез готовых продуктов или дезактивируя их. Открытие РНК-интерференции делает возможной другую стратегию: не обезвреживать нежелательный биохимический продукт (рискуя при этом нарушить какой-нибудь нормально протекающий процесс), а просто нацеливать собственный защитный механизм клетки (комплекс RISC) на определенную иРНК, предотвращая образование нежелательного продукта.

Достаточно только сконструировать правильную микро-РНК. Это на современном этапе вполне выполнимая задача, поскольку геном человека уже секвенирован, а для некоторых болезней известны вполне определенные гены, за них ответственные. Сейчас уже разработан метод РНК-интерференции, который предполагает внесение в клетку дцРНК, специально сконструированной под определенный ген. В 2006 г. исследователями фирмы «SomaGenics» в США разработана новая «антисмысловая» технология RNAi [25] (см. также ссылки на аналогичные разработки на сайте NCBI [26]).

Эксперименты на животных показали, что с помощью дцРНК можно погасить ген, обусловливающий, например, высокий уровень холестерина в крови. Есть надежда в перспективе использовать РНК-интереференцию для лечения вирусных инфекций, в том числе СПИДа, рака и обменных нарушений.

Вот примеры из офтальмологии: новые подходы к лечению макулярной дегенерации сетчатки (macular degeneration) – болезни, которая приводит к потере зрения. Ежегодно в мире регистрируется полмиллиона новых случаев этого заболевания. Болезнь заключается в том, что в центральной части сетчатки неконтролированно растут новые кровеносные сосуды, что приводит к разрушению светочувствительных нервных клеток.

Филадельфийская компания «Acuity Pharmaceuticals» сейчас проводит клинические испытания экспериментального метода лечения макулярной дегенерации сетчатки с помощью РНК-интерференции. Больному непосредственно в глаз вводят короткие фрагменты рибонуклеиновой кислоты, которые заглушают ген, обуславливающий аномальное разрастание капилляров.

Американская фармацевтическая фирма «Sirna» начала клинические испытания первого лекарства, механизм действия которого основан на РНК-интерференции (пока оно называется «Sirna-027»). «Sirna-027» – это специфическая микро-РНК, которая запускает механизм разрушения информационной РНК, обеспечивающей синтез рецептора фактора роста эндотелия сосудов. Для терапевтического применения микро-РНК была химически модифицирована особым образом, поскольку «обычные» РНК, введенные в организм, плохо проникают в клетки и быстро разрушаются.

Сейчас, кроме макулярной дегенерации сетчатки, фирма «Sirna» выполняет программы (пока на доклинических стадиях) по раку, гепатитам В и С, диабету, астме, болезни Хантингтона (прогрессирующая дегенерация нервных клеток, приводящая к инвалидности) и облысению.

Рис. 4.8. Одна из искусственных молекулярных конструкций для доставки генетического материала в клетку, разработанная в Калифорнийском университете в Санта-Барбаре. Водоотталкивающие липидные молекулы (обозначены зеленым) связываются с молекулами ДНК или РНК (обозначены лиловым) в единый комплекс.

Главная проблема в области клинического применения микро-РНК – не конструирование самих молекул, специфических для определенных генов-мишеней, а их доставка в клетку. В отличие от многих обычных лекарств, молекулы РНК сравнительно большие и обладают физико-химическими свойствами, которые мешают им проходить через внешнюю мембрану клетки.

Решением этой проблемы занимается целая отрасль современной науки (drug delivery). Существуют две стратегии: во-первых, применение «готовых» систем доставки РНК или ДНК в клетку, получаемых из некоторых вирусов, а во-вторых, создание искусственных конструкций из молекул (например, липосом).

Теперь о лечении СПИДа. Если удастся тем или иным способом доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо участком РНК-генома ВИЧ, можно попытаться не допустить его встраивания в ДНК клетки хозяина. Возможно также воздействие на различные этапы размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит излечение, однако может существенно уменьшить скорость размножения вируса и дать иммунной системе больного шанс "отдохнуть" от вирусной атаки, и самой попытаться расправиться с остатками заболевания.

На рис. 4.9 крестиками отмечены те два этапа размножения ВИЧ в клетке, которые, как надеются, можно заблокировать с помощью siRNA, (этапы 4-5 - встраивания вируса в хромосому, и этапы 5-6 - сборка вируса и выход из клетки).

Рис. 4.9. Этапы развития ВИЧ [27].

Однако на практике терапия siRNA встречается с затруднениями. Например, в случае антивирусной терапии высокая специфичность siRNA может привести к тому, что быстро мутирующие вирусы уйдут из-под действия РНК-интерференции. Например, частота изменений ВИЧ такова, что у человека, заразившегося одним подтипом вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.

Учитывая эти затруднения, ученые разрабатывают альтернативные варианты противовирусной siRNA-терапии. В случае ВИЧ, например, показано, что блокирование одной из молекул-рецепторов на клеточной поверхности, необходимых для прикрепления вируса к клетке (CCR5, этап 6b на рис. 4.9), также может предотвращать заражение ВИЧ. Преимуществом данного подхода является то, что ген CCR5 и, соответственно, его мРНК, отличается (по сравнению с ВИЧ) гораздо большей стабильностью своего состава, а, значит, подобрать для нее эффективную siRNA гораздо легче.

РНК-интерференция широко используется также в научных целях в функциональной геномике для анализа функций различных генов. После описания нуклеотидных последовательностей геномов многих животных и человека перед наукой встала очередная глобальная задача: выяснить роль каждого гена. Одним из основных инструментов, применяемых генетиками для решения этого вопроса, является "выключение" гена, ведущее к нарушению вполне определенных биохимических процессов.

Если раньше на поиски удачного способа блокировки гена и приведение его в действие требовалось от нескольких месяцев до года, то с помощью метода siRNA, или генного нокдауна, практически с любым геном любого организма, последовательность нуклеотидов которого известна, эту процедуру можно проделать в 1-2 недели, значительно повысив специфичность блокирования. При этом инъекция двуцепочечных фрагментов РНК, комплементарных участку информационной РНК, возможна на различных этапах клеточного цикла. Например, таким способом было систематически инактивировано 5690 генов C.elegans для определения генов, регулирующих продолжительность жизни.