Исследование тонкой структуры гена на примере фага Т4 (Бензер). Понятие о мутоне, реконе и цистроне

В конце 50-х годов С. Бензер провел серию опытов, результаты которых оказались настолько серьезными, что заставили существенным образом изменить представления о структуре гена. Он исследовал большое количество мутаций одного гена — rll (rapid lysis) фага Т4, паразитирующего на кишечной палочке. Этот ген, как и большинство других фаговых генов, ответствен за репликацию и производство потомства данного фага. Часть мутаций может вообще препятствовать появлению потомства (летальные мутации), некоторые мутации способны подавлять размножение фага в одних условиях и не оказывают такого действия — в других (условно летальные мутации).

Фаг Т4 при росте на кишечной палочке убивает все клетки, которые инфицирует, и в результате на поверхности бактериальной культуры появляются стерильные пятна. Скорость образования, величина и прозрачность последних при культивировании дикого штамма отличаются от таковых при культивировании мутанта rll. Фаг Т4 дикого типа (rll+) нормально размножается и образует стерильные пятна также и на штамме К-12 кишечной палочки, лизогенной по фагу. Мутации же rll изменяют продолжительность жизненного цикла фага и препятствуют его росту на штамме К-12, а на дикой культуре Е. coli дают сравнительно крупные стерильные пятна с характерной морфологией. Используя эти фенотипические отличия мутантной формы фага от дикой, Бензер сумел выделить большое количество (в общей сложности свыше 2000) мутантов rll. Для анализа структуры гена rll Бензер использовал функциональный и рекомбинационный тесты на аллелизм. Он проводил попарные скрещивания мутантов, заражая дикий штамм Е. coli одновременно двумя разными мутантными формами фага Т4, вследствие чего в клетках Е. coli создавалось состояние временной диплоидности по гену фага. По результатам скрещивания, согласно цис-транс-тесту, можно было определить, к каким функциональным единицам принадлежат две анализируемые мутации rll — к одной и той же или к разным.

Если потомство фага давало рост на штамме К-12, значит, анализируемые мутации были неаллельными и принадлежали к разным функциональным единицам. Если же рост фага на штамме К-12 отсутствовал, значит, мутации были аллельными, т. е. принадлежали к одной функциональной группе.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что мутации rlla и rllb (при совместном выращивании на штамме К-12 не дали роста) аллельны, т. е. принадлежат одной функциональной единице, a rlla и rile, rllb и rllс — комплементарны, т. е. принадлежат разным функциональным единицам.

Чтобы таким способом изучить 2000 мутантов, потребовалось бы провести около 2 млн попарных скрещиваний, что, естественно, очень трудоемко. Поэтому Бензер использовал для скрещивания мутации, которые не давали возврата к дикому типу. Ими оказались делеции. Их очень легко выделить среди мутантов, поскольку они стабильно не образуют стерильных пятен на штамме К-12, т. е. не дают обратные мутации из-за отсутствия в них того или иного фрагмента хромосомы. При скрещивании такой мутации с анализируемой мутацией в одном случае могли появиться рекомбинаты дикого типа, в другом — нет. Это объяснялось тем, что в первом случае анализируемая мутация не принадлежала области делеции, а во втором — совпадала с ней и, следовательно, относилась к той же функциональной группе, что и делеция. С помощью этого так называемого метода перекрывающихся делеций Бензер установил, что все обнаруженные им мутации принадлежат гену rll и располагаются в линейном порядке. Цис-транс-тест показал также, что участок rll хромосомы фага Т4 состоит из двух функционально самостоятельных единиц — А и В, которые Бензер назвал цистронами.

Цистрон представляет собой хромосомную единицу функции, т. е. отрезок хромосомы, контролирующий, согласно тесту на комплементарность, только одну функцию. Иными словами, цистрон — это участок хромосомы, в пределах которого мутация проявляется в транс-положении. Функциональные группы А и В гена rll комплементарны, т. е. лишь при их взаимодействии фаг Т4 приобретает способность расти в клетках штамма К-12. Если в одной из функциональных групп происходит инактивирующая мутация - полноценного активного белка не осуществляется.

Цис-транс-тест на комплементарность при условии функциональной делимости гена можно представить следующим образом.

Если мутации принадлежат разным цистронам, то при их транс-положении у гибридов развивается дикий фенотип; в этом случае клетка несет по одной полноценной функциональной единице каждого типа. Если мутации принадлежат одному цистрону, то при их транс-положении цистрон будет функционально дефектным и у гетерозиготы сформируется мутантный фенотип.

С помощью рекомбинационного теста Бензер установил, что в пределах каждого цистрона может происходить кроссинговер, т. е. рекомбинация. Наименьший фрагмент хромосомы, который обменивается при кроссинговере, получил название единицы рекомбинации или рекона. Бензер также определил, что в состав цистрона А входит 5 единиц рекомбинации, а цистрона В — 3 единицы. Наименьший участок цистрона, изменение которого может вызвать мутацию, Бензер назвал мутоном. В настоящее время его называют мутантным сайтом или единицей мутации. Он представляет собой часть цистрона, способную мутировать независимо от других его участков. Между сайтами возможна рекомбинация — кроссинговер. По Бензеру, мутон и рекон почти не отличаются по размерам. Установлено, что наименьшая частота рекомбинаций между двумя сайтами составляет 0,02 %. Это соответствует 1/400 области гена rll. В ней было выявлено 308 сайтов, которые распределяются между цистронами следующим образом: 200 сайтов находится в цистроне А, 108 — в цистроне В, т. е. по числу сайтов и по частоте рекомбинаций цистрон А оказывается длиннее цистрона В.

37. Интрон – экзонная организация генов эукариот, сплайсинг. Структурная организация генома эукариот.

Эукариотические гены, в отличие от бактериальных, имеют прерывистое мозаичное строение. Кодирующие последовательности (экзоны) перемежаются с некодирующими (интронами). Экзон [от англ. ex(pressi)on - выражение, выразительность] - участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоны разделены некодирующими участками - интронами. Интрон (от лат. inter - между) - участок гена, не несущий информацию о первичной структуре белка и расположенный между кодирующими участками - экзонами. В результате структурные гены эукариот имеют более длинную нуклеотидную последовательность, чем соответствующая зрелая иРНК, последовательность нуклеотидов в которой соответствует экзонам. В процессе транскрипции информация о гене списывается с ДНК на промежуточную иРНК, состоящую из экзонов и интронов. Затем специфические ферменты - рестриктазы - разрезают эту про-иРНК по границам экзон-интрон, после чего экзонные участки ферментативно соединяются вместе, образуя зрелую иРНК (так называемый сплайсинг). Количество интронов может варьировать в разных генах от нуля до многих десятков, а длина - от нескольких пар оснований до нескольких тысяч.

Ген может кодировать различные РНК-продукты путем изменения инициирующих и терминирующих кодонов, а также альтернативного сплайсинга. Альтернативная экспрессия гена осуществляется и путем использования различных сочетаний экзонов в зрелой иРНК, причем полипептиды, синтезированные на таких иРНК, будут различаться как по количеству аминокислотных остатков, так и по их составу.

Наряду со структурными и регуляторными генами обнаружены участки повторяющихся нуклеотидных последовательностей, функции которых изучены недостаточно, а также мигрирующие элементы (мобильные гены), способные перемещаться по геному. Найдены также так называемые псевдогены у эукариот, которые представляют собой копии известных генов, расположенные в других частях генома и лишенные интронов или инактивированные мутациями.