Генетическая рекомбинация при трансформации. Трансдукция у бактерий. Общая и специфическая трансдукция. Использование трансформации и трансдукции для картирования генов

Трансформация бактерий – это перенос ДНК, изолированной из одних клеток в другие. Длинные фрагменты молекулы ДНК успешно поглощаются клеткой. Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Возникновению компетентности, приобретаемой лишь частью клеток культуры обычно в середине логарифмической стадии роста, способствует особый белок, который вырабатывается в ходе роста культуры. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток. ДНК, связанная с компетентными клетками, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов, которые проникают в клетку. После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одно цепочечную: одна нить ДНК деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки-реципиента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется с ДНК реципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение 10—30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляет около 1 %. Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например в организме инфицированного животного — для Васcilus рпеитоniае, а также в условиях культуры — для Васcilus subtilis. Это означает, что трансформация — не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс. В то же время в последние годы в связи с развитием генной инженерии широко применяется плазмидная, или векторная, трансформация, которая заключается во введении в клетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды. Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер. Известны два основных типа бактериофагов — вирулентные и умеренные. Первые после их размножения в клетке бактерии приводят к ее лизису. Они существуют либо в вегетативном (размножение внутри клетки), либо в зрелом (метаболически инертное состояние вне клетки) состоянии. Умеренные бактриофаги обладают способностью быть в состоянии профага. Профагом был назван геном фага, который включается в бактериальную хромосому, после чего этот геном приобретает способность ауторепродуцироваться вместе с хромосомой бактерии. Такие бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Эти бактерии, хотя они и содержат в своей хромосоме профаг, не имеют в себе инфекционных фаговых частиц. Существование профага является временным. При индукции профаг покидает хромосому бактерий, переходит в вегетативное состояние и размножается. В этом случае в клетке возникают зрелые фаговые частицы, которые вызывают ее лизис. Этот процесс можно вызвать искусственно. Оказалось, что, когда профаг освобождается из хромосомы бактерии, переходя в стадию вегетативного существования, он может уносить с собой часть хромосомы бактерий. При следующем инфицировании гены из фрагмента хромосомы бактерии, унесенного фагом, оказываются способными внедряться в хромосому нового реципиента. Особый интерес имеет так называемая зиготическая индукция, при которой индуцирующим агентом является конъюгация с клеткой Hfr, при последней происходит проникновение хромосомы с профагом из клетки Hfr в нелизогенную клетку F. Обычно при трансдукции переносятся отдельные гены. Однако иногда переносимый сегмент хромосомы содержит два или несколько генов. Анализ таких случаев множественной трансдукции позволил создать карты участков хромосом бактерий. Существует несколько типов трансдукции: общая или неспецифическая - профаг способен включаться в разные места хромосомы бактерии. Это обеспечивает возможность переноса различных локусов из хромосомы хозяина в хромосому реципиента. Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов: а) полная трансдукция - привнесенный ген наследуется стабильно, т.к. интегрирует с хромосомой реципиента; б) абортивная трансдукция – внесенный фрагмент не реплицируется и передается по одной линии при размножении трансдуктантов; 2. специфическая – происходит рекомбинация между фаговой и хромосомной бактериальной ДНК, поэтому фаговые трансдуцирующие частицы обязательно содержат ДНК обоих типов. При использовании рекомбинации по многим генам оказалось возможным построить генетические карты хромосом для генов фагов Т4, Т2, фага лямбда и др. С помощью ряда приемов удалось показать соответствие генетических карт положению генов непосредственно в хромосомах вирусов. При интенсивном перемешивании раствора ДНК происходит разрыв молекул ДНК. Можно добиться режима, при котором молекула ДНК рвется примерно пополам. При заражении бактерий половинками молекул было показано, что они несут в себе половину генетической карты. М. Мезельсон и Дж. Уэйгл показали наличие совпадения расстояния между генами на карте и размером хромосом фага лямбда, используя передачу изотопов при рекомбинировании ДНК фага. Эти генетические карты оказались замкнутыми в круг. Генетические карты кольцевых хромосом изучены для ряда вирусных частиц.

29. Закономерности нехромосомного наследования, отличие от хромосомного наследования. Методы изучения: реципрокные, возвратные и поглощающие скрещивания, метод трансплантации, биохимические методы.

Наследование, определяемое хромосомами, получило название ядерного или хромосомного. В тех же случаях, когда материальной основой наследования являются элементы цитоплазмы, оно называется нехромосомным или цитоплазматическим. Поскольку и у растений, и у животных яйцеклетка содержит много цитоплазмы, а мужская гамета ее, как правило, почти лишена, следует ожидать, что цитоплазматическое наследование, в отличие от хромосомного, должно осуществляться по материнской линии. Цитоплазматическое наследование не может характеризоваться такими строгими количественными закономерностями, как ядерное. Например, воздействие повышенной температурой на яйца самок наездника (Habrobracon juglandis) до оплодотворения приводит к изменению окраски тела у их потомства. В ряде случаев наследование признаков связано с особенностями цитоплазмы, возникающими в процессе индивидуального развития организма либо под влиянием факторов внешней среды (онтогенетическая или фенотипическая предетерминация), либо под влиянием генотипа (генотипическая предетерминация). В этом случае наследование некоторых признаков по материнской линии. Онтогенетическая предетерминация. Обусловлена изменениями в цитоплазме, возникающими в ней под влиянием определенных внешних факторов. Обычно такие изменения нестойки, например, воздействие повышенной температурой на яйца самок наездника до оплодотворения приводит к изменению окраски тела у их потомства. Генотипическая предетерминация цитоплазмы происходит под влиянием генотипа материнского организма. Яркий пример – наследование направления завитка раковины у пресноводных гермафродитных моллюсков Limnea. Большинство из них – перекрестно оплодотворяющиеся формы, но некоторые из них способны к самооплодотворению. У этих моллюсков встречаются два типа закручивания раковины: против часовой стрелки (левозакрученные) и по ходу часовой стрелки (правозакрученные). При этом типе наследования фенотип потомков соответствует генотипу матери, а не генотипу зигот, из которых они развиваются. Данный признак предопределяется генотипом материнского организма в цитоплазме яйца в процессе его развития. В данном случае свойства цитоплазмы детерминированы действием хромосомных генов, а не элементами самой цитоплазмы, то есть здесь действует механизм хромосомного наследования, который изменяет цитоплазму яйцеклетки еще до оплодотворения. Реципрокное скрещивание, система из двух скрещиваний — прямого и обратного. При Р. с. каждый из генотипически различных родительских типов А и В используется дважды — один раз в качестве материнской и другой раз в качестве отцовской форм (♀А ´♂В и ♀В ´♂А). Различия между реципрокными гибридами могут быть вызваны влиянием материнского организма, цитоплазматической наследственности, сцепленными с полом генами. Метод возвратного скрещивания состоит в получении потомства в ряду поколений от скрещивания гетерозиготы (детей гомозиготных родителей, генетически отличающихся друг от друга) с одним из исходных гомозиготных родителей. Смысл подобного скрещивания - замена гена (генов какого-либо комплекса) одной инбредной линии на гаплотип другой. В результате получается конгенная линия, отличающаяся от исходной только по этому гену (генам этого комплекса). Поглотительное скрещивание, преобразовательное скрещивание, один из видов скрещивания, применяемый для коренного улучшения малопродуктивных пород высокопродуктивными. Простое П. с. заключается в спаривании животных двух пород (улучшаемой и улучшающей) для получения помесей, которых затем в ряде поколений спаривают с производителями улучшающей породы до получения животных желательного типа. Высокопродуктивных помесей 4—5—6-го поколений (высококровных), отвечающих типу улучшающей породы, разводят «в себе» (см. Разведение «в себе»), что иногда заканчивается созданием новой породы. П. с., в котором участвуют несколько улучшающих пород, называемых сложным. П. с. — наиболее быстрый и эффективный способ массового улучшения малопродуктивного скота, а также преобразования пород с.-х. животных (например, грубошёрстных пород овец в тонкорунных и полутонкорунных). Скорость преобразования и улучшения пород зависит от степени наследственных различий между животными скрещиваемых пород, степени наследственной устойчивости (консолидации) пород, тщательности отбора и подбора среди помесей, а также условий кормления и содержания помесного молодняка.

Методы трансплантации ядер В нашей стране Б.В. Конюховым и Е.С. Платоновым в 1985 г. был разработан метод менее травматического переноса ядер методом микроманипуляции. Он протекает в два этапа: сначала тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы, а затем другой пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора. Трансплантация ядер может осуществляться и другим способом, с использованием цитохалазинов (веществ, синтезируемых грибами). Цитохалазин В разрушает структуру микрофиламентов и способствует уникальному расположению ядра. Ядро остается соединенным с клеткой тоненьким стебельком цитоплазмы. При центрифугировании этот мостик разрывается, образуются безъядерные клетки (цитопласты) и кариопласты, представляющие собой ядра, окруженные тонким слоем цитоплазмы и цитоплазматической мембраной. Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Они сохраняют способность прикрепляться к поверхности культурального сосуда и могут быть использованы для слияния с кариопластами других клеток с целью получения жизнеспособной клетки. Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы. С помощью биохимических методов описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. К закономерностям цитоплазматического наследования следует отнести: 1) передачу признаков по материнской линии; 2) отсутствие строгих количественных закономерностей расщепления. Принципами цитоплазматической наследственности являются: 1) дискретная детерминация признаков; 2) относительное постоянство плазмогенов; 3) множественность идентичных плазмогенов. Итак, понятие наследования и наследственности следует различать, по надо помнить, что в конечном итоге материальная и функциональная преемственность между поколениями обеспечивается всем и самовоспроизводящимися структурами клетки: ядерными и цитоплазматическими.