Общие методы изолирования

Используются при нецеленаправленном исследовании биоматериал.

Метод Стаса-Отто

50,0-100,0 биоматериала измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой до рН=2-3. Перемешиваем и проверяем значение рН, настаиваем при комнатной температуре в течение суток при периодическом перемешивании и проверяем значение рН. Жидкую фазу сливаем, операцию повторяем 2-3 раза (в течение 2-3 суток), затем биоматериал помещаем на фильтр и промываем спиртом; спиртовые вытяжки объединяют и упаривают на водяной бане при 40-50°С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывают этанолом до прекращения выпадения осадка, жидкость фильтруют, снова упаривают до густоты сиропа и вновь осаждают белки. Остаток обрабатывают 20-25 мл воды, осадок отфильтровывают, проводят экстракцию хлороформа (203 порции), получают кислое хлороформное извлечение. Водную фазу подщелачивают 25% раствором NH4OH до рН=9-10, извлекают хлороформом (2-3) порции, получают щелочное хлороформное извлечение.

1. Для подкисления используют органические кислоты для избежания гидролиза сложноэфирных, амидных и других связей.

2. Для подщелачивания берут только NH4OH т.к. при использовании NaOH будут образовываться феноляты, ХР в воде.

Достоинства метода:

1. Данный метод является общим, им можно извлечь большую группу ТВ.

2. Извлечение получается чистым, можно работать с несвежим биоматериалом.

3. Этанол является универсальным растворителем и извлекает большое количество ТВ.

Недостатки:

1. Метод чрезвычайно длительный (7-10 рабочих дней).

2. Большое количество осаждений молекул приводит к потере ТВ.

3. Этанол является дорогостоящими растворителем.

Метод Васильевой.

50-100,0 биоматериала измельчают и заливают водой, подкисляя щавелевой или винно-каменной кислотой и настаивают при комнатной температуре в течение 1 часа, перемешивают, проверяют значение рН, вытяжку фильтруют, центрифугируют и экстрагируют хлороформом (трижды) – осторожно, во избежание эмульгирования с водой. Водную фазу подщелачивают 20% NaOH и трижды экстрагируют хлороформом.

Достоинства:

1. Быстро (в течение 1 рабочего дня).

2. Дешево.

3. Почти отсутствуют потери ТВ из-за многократной очистки вытяжки.

Недостатки:

1. Вода является не универсальным растворителем. Извлечение содержит большое количество балластных веществ, возможно образование эмульсии на этапе экстракции. Нельзя использовать с несвежим биоматериалом.

Частные методы изолирования:

Применяют при целенаправленно исследовании биоматериала.

На производные барбитуровой кислоты – метод Валова.

Биоматериал измельчают (50-100,0) и заливают 80 мл воды + 20 мл 10%NaOH, настаивают 0,5 часа при периодическом перемешивании. Извлечение сливают, центрифугируют, к центрифугату добавляют 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и 1М H2SO4 до рН=2 (образуется вольфрамовая кислота, осаждает белки). Нагревают и кипятят 20 минут, центрифугируют, центрифугат переносят в делительную воронку и проводят извлечение эфиром. К эфирному слою добавляют 50 мл 10%NaOH, водную фазу отделяют, добавляют 25%H2SO4 до рН=2 и вновь извлекают эфиром (метод реэкстракции). Настаивание производят в щелочной воде, т.к. барбитураты образуют соли.

Достоинства:

1.Хороший выход извлечения барбитуровой кислоты.

2. Недорого, недлительно.

3. Вытяжка получается чистой

Недостатки:

1. Частный метод (для других ТВ большие потери).

Метод Поповой.

50-100,0 биоматериала измельчают, прибавляют 80 мл 0,01М H2SO4 до рН=2-3, перемешивают, проверяют рН, настаивают 2 часа, водную вытяжку сливают, процедуру повторяют 2 раза, водные вытяжки объединяют и центрифугируют, очищают от примесей гель-хроматографией. Колонка «Сефадекс», «Д25». Элюат – концентрируют хлороформом.

Достоинства:

1. Частный метод.

2. Чистая вытяжка.

Недостатки:

1. Дороже, т.к. необходима чистка для колонки хроматографа.

На алкалоид – метод Кроморенко.

50-100,0 биоматериала измельчают и заливают 0,02М раствором H2SO4 до рН=2,5 (гидролиз алкалоидов не происходит, а извлечение лучше), настаивают 2 часа при периодическом перемешивании, проверяют рН,, водный слой процеживают. Операцию проводят 2 раза. Водную вытяжку объединяют, центрифугируют, добавляют сульфат аммония до насыщения (высаливание α-белков), центрифугируют, и извлекают эфиром 2-3 раза. К водной фазе прибавляют небольшими порциями раствор NaOH 20% (водная фаза содержит (NH4)2SO4 + NaOH à NH4OH, которым и происходит подщелачивание) до рН=9-10 и экстрагируют эфиром или хлороформом.

Достоинства:

1. Частный метод ля алкалоидов, для синтетических веществ основного характера.

2. Быстро.

3. Вытяжка получается чистая.

Недостатки:

1. Для веществ кислого характере – плохо. Для некоторых групп алкалоидов – плохое извлечение.

Кофеин рН=4-5

Теофиллин рН=4-7

Промедол рН=7-8,5

Скополамин рН=8-10

Атропин рН=9-12

Хинин рН=10

На производные фенотиазина – метод Соломатина.

Биоматериал измельчают и заливают абсолютным этанолом, подкисляют щавелевой кислотой до рН=2-3 (оксалаты фенотиазина ХР в этаноле), настаивают 2 часа, вытяжку сливают, операцию повторяют 3 раза, обхединенную вытяжку упаривают на водяной бане до густоты сиропа. белки осаждаются абсолютным этанолом (смотри метод Стаса-Отто), спиртовую вытяжку упаривают досуха и растворяют в воде. Нагревают до 40-50°С, осадок отфильтровывают и проводят экстракцию эфиром 2 раза при рН=2-3. Возможно определение веществ кислого характера. Водную фазу подщелачивают до рН=13, и извлекают эфиром 2-3 раза. Эфирное извлечение обрабатывают водой, подкисляют 0,5М H2SO4, часть водной вытяжки хранят или используют для СФМ, частично вновь экстрагируют эфиром из щелочной среды и исследуют химическими методами.

(Производные фенотиазина в сухом виде быстро окисляются, поэтому их хранят в сернокислой среде).

Изолирование веществ из биожидкостей.

Проводят прямую жидкость-жидкость экстракцию.

К биожидкости (кровь, моча, промывные воды) с определенным значение рН (2-3 или 9-10) и затем экстрагируют органическим растворителем (хлороформ, эфир). В качестве очистки для крови используют высаливание (NH4)2SO4 или вольфраматом Na + H2SO4.

В моче – проводят реэкстракцию.

Если вещество подвергается метаболизму и в моче находится в виде глюкуронидов или сульфатов, проводят кислотный (производные 1,4-бензодиазепина) или ферментный (морфин) гидролиз. Или выполняют восстановление дитионитом натрия N-оксидов (морфин).

В качестве биожидкости может быть использована желчь.

Метод Груцхарди. Для бензонала, наксерона.

Производное пиримидина,