Механизм и энзимология репликации ДНК

Как ген воспроизводится: репликация ДНК

Репликация - это матричный процесс, лежащий в основе воспроизведения генетической информации и последующей пере­дачи её следующему поколению клеток в процессе деления (мито­за).

Структура молекулы ДНК - двойная спираль, основанная на водородных связях между комплементарными нуклеотидными основаниями - дает возможность точного воспроизводства, реп­ликации молекул на своей же основе. Никакая другая органиче­ская молекула к этому не способна.

Матрицей являются обе спирали ДНК, продуктами матрич­ного синтеза - комплементарные им новые спирали.

Репликация в основном происходит в период S-интерфазы, но некоторые участки ДНК (район центромеры, например) имеют более растянутый во времени процесс, вплоть до начала профазы митоза.

Из трех имеющихся гипотез о принципе механизма репли­кации (Дельбрюк, Стент, 1957) наиболее распространенным в жи­вом мире оказался полуконсервативный механизм репликации. Именно так представляли этот процесс Дж.Уотсон и Ф.Крик (1953г.)

Суть его в том, что молекула ДНК разделяется продольно с помощью ферментов на две спирали и по мере их отделения про­исходит присоединение к освободившимся нуклеотидам свобод­ных, имеющихся в кариоплазме нуклеотидов. В результате каждая спираль достраивается снова до двойной, а вместо одной молеку­лы ДНК получается две, совершенно идентичных. Таким образом, хромосома становится двухроматидной.

Две другие гипотезы принципа репликации: консерватив­ная (исходная молекула ДНК - матрица для образования совер­шенно новой другой двухцепочечной молекулы) и дисперсион­ная (распад исходной ДНК на фрагменты, их репликация и по­следующее соединение) оказались маловероятными и, возможно, встречаются лишь у некоторых вирусов, как исключение.

Полуконсервативный механизм репликации ДНК, доказан­ный М.Мезельсоном и Ф.Сталем (1957), оказался универсальным для воспроизведения генетического материала и показал справед­ливость модели структуры ДНК, описанной Дж.Уотсоном и Ф.Криком.

Процесс репликации протекает весьма сходно в клетках пpo­ll эукариот, однако имеются несущественные особенности, из ко­торых можно выделить следующие:

□ У прокариот хромосома представлена одним репликоном, т.е. имеет одну начальную точку, или вилку редупликации. У эука­риот хромосомы разделены на отдельные участки - репликоны, т.е. вилок редупликации может быть достаточно много.

□ Скорость репликации у прокариот выше, чем у зукариот. Так, у E.coli скорость репликации 1500-3000 п.н./сек, а у эукариот в среднем 160-300 п.н./сек. Одна из причин этого: ДНК прокариот не связана с гистонами, как у эукариот.

Энзимология репликации Механизм репликации ДНК требует участия в нем многих ферментов, так как нужно обеспечить разделение комплементар­ных цепей ДНК, закрученных одна вокруг другой, а также собрать из свободных нуклеотидов две новые спирали.

В разделении цепей ДНК участвуют ферменты, относящиеся к классу топоизомераз. Один из таких ферментов - топоизомераза II или гираза переводит ДНК в состояние отрицательной сверх- спирализации. Это необходимо для того, чтобы снять положи­тельные сверхвитки, возникающие при раскручивании двойной спирали. Затем другая топоизомераза - хеликаза - раскручивает эту сверхспираль, происходит "плавление" ДНК или разъединение спиралей. Процессы АТФ-зависимы, т.е. требуют затрат энергии. Особые белки удерживают однонитевые участки ДНК, обеспечи­вая возможность репликации.Синтез новых цепей может происходить только в направлении 5'-~>3', поэтому только одна из разъединенных цепей может синтезироваться не­прерывно. Это будет цепь 3'.5", и её называют лидирующей.

Другая цепь, 5'..... 3', называется отстающей и синтезируется

только в виде фрагментов из 100-200 нуклеотидов (фрагменты Оказаки).

Синтез как на лидирующей цепи, так и на фрагментах Оказа- ки начнется с синтеза короткого участка РНК (10-60 нуклеотидов) при участии РНК-полимеразы-праймазы. Этот участок, называе­мый РНК-затравкой или праймером. затем удаляется как с 5' кон­ца модифицирующей цепи, так и с 5'-концов фрагментов Оказаки с помощью фермента ДНК-полимеразы I, действующей как 3'—>5' экзонуклеаза. У эукариот эту роль, вероятно, выполняет ДНК- полимераза р.

Основную работу по синтезу новых цепей ДНК выполняет фермент ДНК-полимераза III у прокариот, а у эукариот ДНК- полимераза а. ДНК-полимера за I (или р ■■ у эукариот), после уда~ ления праймеров заполняет получившиеся однонитевые бреши комплементарными нуклеотидами, а также выполняет корректор­ские функции: исправляет ошибки, допущенные ДНК- полимеразой III, удаляя неправильно поставленные нуклеотиды и заменяя их нужными.

Еще один класс ферментов - ДНК-лигазы осуществляют со­единение фрагментов Оказаки, формируя целостную систему. У эукариот выделяют также ДНК-полимеразу-у, которая, видимо, участвует в репликации мтДНК.

Митоз

Митоз - это способ деления эукариотических клеток, при котором каждая из двух образующихся клеток получает генетический материал, идентичный исходной клетке. Этому делению обязательно предшест­вует репликация ДНК. как носителя генетической информации, что происходит в период интерфазы.

Клеточный цикл

Период жизни клетки от одного деления до другого (или от деле­ния клетки до ее смерти) называют клеточным циклом. Этот период состоит из интерфазы и митоза. Длительность интерфазы значительно дольше, чем митоза, однако в клетках различных типов протяженность как одного, так и другого варьирует весьма значительно.

Интерфазу подразделяют обычно на три периода:

Gj - пресинтетический, когда клетка увеличивается в размерах, активно синтезирует РНК, белки, развивается система органоидов •леп ки - рибосом, эндоплазматического ретикулума и др. Иногда клет­ка из периода G; переходит в состояние G₀: при этом отмечается диф­ференцированное развитие цитоплазмагаческих структур, изменение активности части генов, т.е. происходит специализация или дифферен­циация клетки. Такая клетка определенное время выполняет свои Еункции (эритроциты, например, участвуют в переносе О2 и С0₂, ней- "эофильные гранулоциты фагоцитируют бактерии и т.д.), а затем отми­рает. Делиться эти клетки уже никогда не будут.

Однако в многоклеточном организме всегда сохраняется пул не­дифференцированных клеток, сохраняющих способность к митозу и шляющихся источником замены отмирающих клеток. Такие клетки ■ступают после G/ -периода в период 5.

5-период (синтетический) характеризуется не только продолжаю­тся синтезом РНК и белков, но и синтезом ДНК - процессом репли­кации (см. гл.4). Удвоение числа молекул ДНК и соединение их с хро- Жюмными белками приводит к тому, что в конце S-периода каждая мосома оказывается удвоенной, состоящей из двух сестринских шгоматид. Число хромосом в клетке не увеличивается, хроматиды тес­ин:: сближены и соединены в области центромеры.

G₂-период-постсинтетический. Клетка готовится к делению: синтезируются белки микротрубочек, из которых затем собирается ахроматиновое веретено, запасается энергия (АТФ).

Перед началом митоза хромосомы уже удвоены, но находятся в деснирализованном состоянии.

В профазе хромосомы спирализуются, становятся четко выраже­ны сестринские хроматиды. Ядрышко исчезает, ядер­ная оболочка распадается на фрагменты, хромосомы оказываются в миксогшазме - смеси кариоплазмы и цитоплазмы. Центриоли расходятся к полюсам клет­ки, начинает формироваться ахроматиновое веретено.

Метафаза: хромосомы выстраиваются в плоскости экватора, об­разуя метафазную пластинку. Тянущие нити ахрома- тинового веретена связываются с сестринскими хро- матидами в районе центромеры. Как и в профазе, клетка пока имеет 2п, 4с (п - гаплоидное число хромо­сом, с- число молекул ДНК)

Анафаза начинается синхронно в момент деления центромер.

Сестринские хроматиды становятся уже самостоя­тельными хромосомами и при участии нитей ахрома- тинового веретена расходятся к полюсам клетки. Клетка имеет 4п. 4с.

Телофаза: хромосомы деспирализуются, формируются ядрышко и ядерная оболочка. Одновременно происходит цито­кинез - разделение цитоплазмы. Обе клетки имеют 2п, 2с.

Значение митоза заключается в точной передаче наследственной информации.

9.Мейоз - это два деления, лежащие в основе образования гаплоид­ных клеток-гамет у животных или спор у высших растений. Первое деление мейоза называют редукционным, так как именно после него образуются гаплоидные клетки (с удвоенными хромосомами!). Во вто- ром - эквационном - делении расходятся сестринские хроматиды (рис 1.6).

Перед первым мейотическим делением происходит репликация

ДНК.

Профаза I - наиболее сложная стадия, подразделяемая на лепто- тену, зиготену, пахитену, диплотену и диакинез.

Лептотена (стадия тонких нитей) - это начало спирализации хромосом.

Зиготена – гомологичные хромосомы начнают сближаться, и к концу зиготены конъюгация завершается. Продолжается спирализация.

Пахитена (стадия толстых нитей). Хромосомы полностью спирализованы, конъюгация максимальна. В этот период отчетливо выявляются биваленты (тетрады) - группы из двух гомологичных хромосом, каждая из них состоит из двух сестринских хроматид. Число бивалентов (тетрад) равно п.

На стадии диплотены биваленты наиболее четкие, но уже начи­нается отталкивание гомологов и видны хиазмы, которые свидетельствуют о кроссинговере - возможном обмене гомологичных хромосом идентичными участками.

Примечание: Именно на стадии диплотены в овоцитах животных и человека происходит амплификация (множественное увеличение) ядрышек (до 1000 на ядро), а также наблю­дается деспирализация некоторых участков хромосом с образованием типа "ламповых щеток". Это свидетельст­вует об активизации процессов транскрипции, в цито­плазму выбрасывается большое число молекул всех ти­пов РНК, субъединиц рибосом. Процессы эти необходи­мы, так как начальные этапы развития зиготы происходят под контролем цитоплазматических РНК материнской клетки. Гены отцовской клетки начинают функциониро­вать только со стадии гаструлы.

Диакинез - завершение профазы. Исчезают ядрышки, распадается ядерная оболочка.

Метафаза I. Существенное отлитие от метафазы митоза в том, что тянущие нити ахроматинового веретена присоединя­ются к центромерам удвоенных хромосом. Таким обра­зом, гомологичные хромосомы, входящие в состав одного бивалента, "ориентированы" на разные полюса клетки.

Анафаза I. К полюсам клетки перемещаются гомологичные хро­мосомы (удвоенные!)

Телофаза I. Образуется ядерная оболочка, восстанавливается структура ядра. Образуются две клетки, содержащие гап­лоидный набор удвоенных хромосом (п, 2с).

После кратковременной интерфазы (или интеркинеза) начинается второе деление мейоза. Это деление напоминает обычный митоз, но ему не предшествует репликация. Происходит расхождение сестрин­ских хроматид, рсплицированных еще перед первым делением. Всего в результате мейоза образуется четыре клетки, каждая имеет In, 1с. Клетки имеют разную комбинацию генетического материала, а поэтому не являются идентичными.

Значение мейоза:

1-осуществляется редукция числа хромосом и образуются гаплоидные клетки. Это необходимо для сохранения постоянного числа хромосом в поколениях организмов, размножающихся половым путем.

2-является источником комбинативной изменчивости. Комбинация генетического материала обеспечивается независимым расхождением негомологичных хромосом, а также возможностью кроссинговера – обмена участками гомологичных хромосом.