Методы определения цитокинов

Определение содержания цитокинов в различных биологических жидкостях имеет большое значение в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. В отдельных случаях (септический шок, бактериальный менингит), когда цитокины, в частности ФНОα, выступает в качестве ведущего фактора патогенеза, определение его содержания в крови или спинномозговой жидкости становится основным методом иммунологической диагностики. Иногда уровень цитокинов определяют с целью дифференциальной диагностики. Например, при бактериальном менингите в спинномозговой жидкости определяется ФНОα, а при вирусных менингитах в ней обнаруживается, как правило, только ИЛ‑1. Однако определение присутствия цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях может давать отрицательные результаты в связи с особенностями этих пептидов. Являясь в основном короткоживущими регуляторами, цитокины имеют небольшой полупериод жизни (до 10 мин). Некоторые цитокины содержатся в крови в крайне низких концентрациях, накапливаясь в основном в очаге воспаления, кроме того, биологическая активность цитокинов может маскироваться при связывании их с молекулами ингибиторов, циркулирующих в крови.

Существующие два методических подхода к выявлению и количественному определению цитокинов в биологических жидкостях - биологический и иммунохимический (ИФА) - имеют каждый свои недостатки.

Тестирование по биологическим эффектам, как правило, недостаточно чувствительно и иногда недостаточно информативно. Присутствие в той же биологической жидкости молекул ингибиторов или антагонистов может маскировать биологическую активность цитокинов. При этом нередко разные цитокины проявляют одинаковую биологическую активность. Кроме того, постановка биологических тестов требует специального дополнительного оснащения, проводится в нестандартных условиях и используется преимущественно в научно-исследовательских целях.

Биологические методы разработаны для определения активности ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИФНγ, ФНОα. Биологическое тестирование ИЛ-1 основано на его способности стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов линии C3H/He, стимулированных к пролиферации митогенами, интенсивность которой оценивают по реакции бласттрансформации по включению меченного изотопом тимидина. Добавление соответствующих МКАТ к цитокинам в культуре блокирует их биологическую активность, что является доказательством того, что сигналом к пролиферации клеточной линии служит определяемый цитокин.

Активность ФНОα оценивают по цитотоксическому действию на линию трансформированных фибробластов мышей L-929 с определением интенсивности разрушения клеток в культуре. За условную единицу ФНОα принимают разведение исследуемого образца, необходимое для получения 50% клеточной цитотоксичности.

Для определения биологической активности интерферона (ИФН) в исследуемых жидкостях проводят их титрование на диплоидной культуре фибробластов человека М19 в присутствии вируса везикулярного стоматита. В отсутствии ИФН вирусы вызывают деструкцию монослоя. За единицу активности ИФН принимают величину, подавляющую деструкцию монослоя на 50%. Для определения типа ИФН в систему добавляют специфическую антисыворотку против ИФНα, ИФНβ или ИФНγ. Антисыворотка отменяет действие соответствующего ИФН, что позволяет идентифицировать его тип.

Биоанализ для определения ИЛ-2 основан на способности цитокинов поддерживать рост Т - лимфоцитов, стимулированных митогеном, и поддерживать длительный рост ИЛ-2 зависимой линии Т-клеток в культуре CTLL (линия цитотоксических Т-лимфоцитов). При оценке активности ИЛ-4 учитывают его стимулирующее влияние на синтез ДНК в В-клетках, стимулированных к пролиферации антителами к Ig M.

Более широкое распространение получило определение цитокина в сыворотке крови и других биологических материалах с помощью твердофазного ИФА. Исследование проводится в соответствии с протоколом, прилагаемом к диагностической тест-системе. Чаще всего применяют вариант сендвич-ELISA, заключающийся в следующем: один тип МКАТ к определенному цитокину иммобилизируется на внутренней поверхности ячеек планшетов для исследования. В лунки планшета вносят исследуемый материал и соответствующие стандарты и контроли. После инкубации и промывки в лунки вносят вторые МКАТ к другому эпитопу данного цитокина, конъюгированные с индикаторным ферментом (пероксидазой хрена). После инкубации и промывки в ячейки вносят субстрат-перекись водорода с хромогеном. В процессе ферментативной реакции изменяется интенсивность окраски лунок, которую измеряют на автоматическом фотометре для планшетов.

ИФА с применением МКАТ против отдельных эпитопов в молекуле цитокинов отличается высокой чувствительностью и специфичностью, кроме того, преимуществом метода является объективный автоматизированный учет результатов. Однако этот метод также не лишен недостатков, так как обнаружение присутствия молекул цитокинов еще не является показателем их биологической активности, возможность ложноположительных результатов из-за перекрестно реагирующих антигенных эпитопов, использование ИФА не дает возможности определения цитокинов в составе иммунных комплексов.