Методы определения иммуноглобулинов

Для количественного определения содержания Ig различных классов в сыворотке крови и других биологических жидкостях широкое применение нашли различные варианты постановки реакции преципитации в геле и в жидкой среде, а также метод ИФА.

Определение иммуноглобулинов в реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) по Манчини. Метод основан на феномене преципитации, когда взаимодействие антигенов с антителами в геле сопровождается образованием видимого осадка – преципитата. При постановке реакции используются моноспецифические сыворотки против Ig G, М и А человека. Контрольная сыворотка представляет собой смесь сывороток крови доноров (не менее чем от 500) с известным содержанием иммуноглобулинов. В условиях опыта исследуемые сыворотки вносят в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергированы моноспецифические сыворотки. Размер образующегося кольца преципитации вокруг лунки прямо пропорционален концентрации исследуемого Ig, содержание которого определяют относительно контрольной сыворотки.

Для постановки реакции на поверхности стеклянной пластины готовят слой 3% агара на веронал-мединаловом буфере в смеси с монорецепторной сывороткой в двойном титре. В толще агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. На пластине делают несколько рядов лунок. В лунки первого ряда с помощью микродозатора вносят по 2 мкл стандартной сыворотки неразведенной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Лунки следующих рядов заполняются исследуемыми сыворотками. Пластины выдерживают во влажной камере в течение 24 часов для определения IgG и IgА, и 48 часов для определения IgМ при комнатной температуре. Для учета результатов измеряют диаметр образовавшихся колец преципитации с помощью линейки Behringverke. Уровень Ig определяют по калибровочному графику, выражающему зависимость между уровнем Ig и диаметром преципитации.

В некоторых случаях при учете результатов отмечается образование двойных колец преципитации, что связано с присутствием в исследуемой сыворотке парапротеинов. Появление парапротеинов у больных наблюдается при миеломной болезни (L-цепи Ig – белки Бенс-Джонса), моноклональный IgМ является признаком макроглобулинемии Вандельстрема.

Чувствительность данного метода составляет 10 мкг/мл, ошибка – 15%.

Нефелометрия - определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе по оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации белков, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, СЗ, С4, фактора В, С-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов.

Турбидиметрия – определение концентрации взвешенных частиц, основанная на оценке интенсивности поглощения ими света, проходящего через этот раствор.

При интерпретации результатов исследования иммуноглобулинов необходимо учитывать, что их уровень зависит от возраста. Изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке может быть следствием нарушения их синтеза, катаболизма или выведения.