Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО2. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.
Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО2 не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (бурштинової кислоти).
Для зв’язування СО2, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)2. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО2 визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сульфатної кислоти.
Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин Са(ОН)2, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H2SO4, термостат, штатив із пробірками, піпетки
Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:
Вміст пробірок | Пробірки | ||
Контроль | Дослід №1 | Дослід №2 | |
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
Розчин пірувату натрію, мл | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Малонова кислота, мл | – | – | 0,5 |
Фізіологічний розчин, мл | 0,5 | 0,5 | – |
Розчин Са(ОН)2, мл | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Суспензія мітохондрій, мл | – | 0,5 | 0,5 |
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння, мл | 0,5 | – | – |
Інкубація в термостаті: 15 хв при температурі 37оС | |||
0,1 М розчин H2SO4, мл | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Результати: виділення бульбашок СО2 |
Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв при 37оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0 мл 0,1 М розчину H2SO4 і спостерігають за вивільненням бульбашок СО2.
За результатами проведеного експерименту зробити висновки.
Дата публикования: 2014-11-18; Прочитано: 652 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!