Основы биотехнологии 4 страница

- переносящие ионы водорода или электроны; связаны с окислительно-восстановительными ферментами (НАД, НАДФ, ФАД);

- участвующие в переносе групп атомов (АТФ, КоА, тетрагидрофолат, пиридоксальфосфат);

- катализирующие реакции синтеза, распада и изомеризацию углеродных связей (тиаминпирофосфат, биотин, производные витамина В₁₂).

У ряда регуляторных ферментов имеется еще один центр - аллостерический. Присоединение к этому центру низкомолекулярных веществ (эффекторов) индуцирует изменение третичной структуры фермента, в том числе и в области активного центра. Это и ведет к изменению каталитической активности фермента.

Белки-ферменты с четвертичной структурой могут катализировать одну и ту же реакцию, но несколько отличаться по строению (т.е. первичной структуре) субъединиц. Если это закреплено генетически - мы говорим об изоферментах. Например, фермент лактатдегидрогеназа состоит из 4-х субъединиц 2-х типов Н и М и возможно 5 вариантов, т.е. изоферментов.

В настоящее время описано более 2000 ферментов. Молекулярная масса ферментов составляет от 150000 до миллиона Да и выше.

k+1 k2 Ферментативный катализ идет в 3 стадии: E + S ® ES ® (EZ - EP) —®E + P k-1

Механизмы действия ферментов. 1) По Фишеру: субстрат подходит к ферменту (т.е. активному центру) как ключ к замку. 2) По Кошланду: субстрат изменяет конформацию активного центра фермента, делая ее комплементарной (индуцируемая адаптация фермента к субстрату; рука - перчатка).

1) Образование фермент-субстратного комплекса: E + S «ES быстрая стадия, соответствующая фиксации субстрата на якорном участке активного центра. Ускорение реакции достигается за счет сближения и правильной ориентации субстратов относительно друг друга и увеличения их эффективной концентрации (поскольку в растворе их столкновения случайны). 2) ES ® EZ ® EP На стадии фермент-субстратного комплекса происходит химическая реакция через переходное состояние с образованием продукта реакции на поверхности фермента. Как правило, субстрат вступает во временные промежуточные реакции (взаимодействия) с определенными функциональными группами активного центра, в результате чего реакция требует более низкой энергии активации. 3) EP ® E + P. Продукт отделяется, а фермент в неизменном виде может вновь вступать в катализ.

Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций. 1) Влияние концентрации субстрата. При увеличении концентрации субстрата и при постоянной концентрации фермента скорость реакции вначале увеличивается линейно (реакция первого порядка), затем переходит в реакцию смешенного порядка и, достигнув Vmax, превращается в реакцию нулевого порядка.

По Михаэлису-Ментен скорость реакции описывается уравнением:

Vmax × [S] разделить на [S] Vmax k-1 V= ¾¾¾¾¾ ¾¾—¾¾¾® ¾¾¾, где Ks = ¾— Ks + [S] 1 + Ks k+1 [S]

(константа диссоциации комплекса ES равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакции).

Vmax V = ¾¾¾¾, 1 + Km [S]

Это уравнение описывает участок реакции первого порядка. Для описания всей кривой Бриггс и Холдейн модифицировали уравнение:

где Km - константа Михаэлиса: это такая концентрация субстрата, при которой V = 1/2 Vmax. Величина Кm определяется графически по кривой зависимости V от [S]: по оси ординат откладывают Vmax/2, опускают перпендикуляр на кривую и от точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Отмеченный отрезок и есть Кm. Если Кm велика, то это означает, что потребуется много субстрата для достижения Vmax/2 (сродство фермента к субстрату низкое, медленная скорость реакции). Низкая величина Кm указывает, что для достижения половинной скорости требуется мало субстрата (высокое сродство, высокая скорость реакции). Для точного измерения величин Vmax и Km используют график прямой, построенный на основании модифицированного уравнения Михаэлиса-Ментен (график Лайнуивера и Берка):

1 Km 1 1 ¾ = ¾¾— × ¾¾ + ¾—¾ V Vmax [S] Vmax

2) Влияние концентрации фермента. При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента. Эта зависимость подчиняется уравнению прямой V = k × [E], где [E] - концентрация фермента.

3) Влияние температуры. Скорость химической реакции повышается в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С. Однако из-за белковой природы фермента повышение температуры приведет к тепловой денатурации молекул фермента. Поэтому оптимум температуры для ферментов растений при 45-50 °С, а для ферментов теплокровных ~37 °C. Есть исключения: миокиназа мышц выдержи­вает температуру 100 °C.

4) Влияние рН среды. Ферменты, подобно всем белковым молекулам несут заряженные группы. Общий заряд белковой молекулы зависит от рН среды. Зависимость скорости ферментативной реакции от величины рН носит колоколообразный характер. Большинство ферментов проявляют максимальную активность в узком диапазоне рН - оптимум рН. Для большинства ферментов оптимум рН ~ 7.4; однако для пепсина 1-1.5; для трипсина 8.6.

Классификация ферментов. Ранее ферменты назывались по наименованию субстрата с добавлением суффикса - аза (amylon - амилаза, lipоs - липаза, protein - протеиназа). Позже, ферменты, катализирующие сходные реакции, получили название по типу реакции: дегидрогеназы, оксидазы, декарбоксилазы и др. Международный Совет Биохимиков (IUB) предложил положить в основу наименования и классификации ферментов тип химической реакции и ее механизм:

1) Реакции и ферменты их катализирующие делят на 6 классов, каждый из которых состоит из 4-13 подклассов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы).

1.1. Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов А и В: А восстан. + В окислен «А окислен. + В восстан. Систематические названия их составляют по форме "донор: акцептор оксидоредуктазы". Например: ЛГД - лактат: НАД⁺ оксидоредуктаза (тривиальное название лактатдегидро­геназы). Различают следующие основные оксидоредуктазы: оксидазы (аэробные дегидрогеназы), которые катализируют перенос протонов (электронов) на кислород (на атом кислорода); анаэробные дегидрогеназы, катализирующие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; цитохромы, обеспечивающие перенос только электронов; каталаза и пероксидаза, катализирующие реакции с участием перекиси водорода (перенос протонов и электронов на молекулу кислорода).

1.2. Трансферазы. К классу трансфераз относятся ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса групп Х (отличной от атома водорода) с субстрата А на субстрат В: А-Х + В «А + В-Х. Катализируют перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Наименование этих ферментов составляется по форме: “донор: транспортируемая группа - трансфераза". Например, Ацетил-КоА + Холин «КоА + Ацетил-холин. Эту реакцию катализирует фермент ацетил-КоА: холин-О-ацетил­трансфераза (короче - холин-ацетилтрансфераза).

1.3. Гидролазы катализируют гидролиз эфирных, сложноэфирных, пептидных и гликозидных связей, кислородных ангидридов, связей С-С, С-галоген и Р-N, т.е. расщепление внутримолекулярных связей с участием воды. Наименование их составляется по форме: "субстрат - гидролаза". Например, Ацетилхолин + Н₂О «Холин + Уксусная кислота. Фермент называется ацетилхолин-ацилгидрола­за. К этому классу относят эстеразы (гидролиз и синтез сложных эфиров); гликозидазы (разрыв гликозидных связей); фосфатазы и пептидгидролазы (разрыв фосфоангидридных и пептидных связей) и др.

1.4. Лиазы - это ферменты, отщепляющие группы от субстратов по негидролитическому (без участия воды) механизму, с образованием двойных связей.

Ферменты действуют на связи С-С, С-О, С-N, С-S и С-галоген. Название ферментов: "субстрат-лиаза". Например, L-малат «фумарат + Н₂О. Этот фермент называется L-малат-гидролиаза (тривиальное название - фумараза).

К этому классу относят декарбоксилазы (карбокси-лиазы, амилазы-лиазы и др.).

1.5. Изомеразы катализируют различные типы оптических, геометрических и позиционных изомеров). Название этих ферментов составляется с учетом типа реакции: "Субстрат-цис-транс-изомераза (например транс-ретиналь - 11 цис-транс изомераза катализирует превращения транс-ретиналя в 11-цис-ретиналь при восприятии света); "альдегид-кетон-изомераза" (D-глицеральдегид-3-фосфаткетон-изомераза катализирует превращение D-глицеральдегид-3-фосфата в дигидроксиацетонфосфат); если изомеризация включает внутримолекулярный перенос группы, то фермент получает название мутазы. К классу изомераз относят так же рацемазы и эпимеразы.

1.6. Лигазы катализируют соединения двух молекул, сопряженное с разрывом пирофосфатной связи АТФ или другого макроэргического соединения. Систематическое название этих ферментов составляют по форме "А: В лигазы", где через А и В обозначают исходные вещества. В этот класс включены ферменты, катализирующие реакции образования связей С-О, С-S, С-N, С-С. Например, образование С-N связи при синтезе глутамина катализирует фермент L-глутамат: аммиак лигаза, тривиальное название глутаминсинтетаза: АТФ + L-глутамат + NH₄⁺ «АДФ + ортофосфат + L-глутамин.

2) Наименование фермента имеет 2 части. Первая - наименование субстрата или субстратов. Вторая, оканчивающаяся на -аза, показывает тип катализируемой реакции.

3) Дополнительная информация, например, малатдегидрогеназа (декарбокси­лирующая): L-малат +НАД⁺ ® пируват + СО₂ + НАДН + Н⁺.

4) Каждый фермент по классификации ферментов (КФ, ЕС) обозначается че­тырьмя цифрами: 1-класс, 2-подкласс, 3-подподкласс, 4-номер фермента в списке. Так, КФ 2.7.1.1. означает: класс 2 - трансферазы, подкласс 7 (перенос фосфата), подподкласс 1 (алкогольная группа - акцептор фосфата). Конечное название - гексокиназа, или АТФ:D-гексоза-6-фосфотрансфераза, фермент, катализирующий перенос фосфата с АТФ на гидроксильную группу у 6 углеродного атома глюкозы.

Единицы измерения активности и количества ферментов. Для выражения концентрации фермента рекомендуется стандартная единица (Е). 1) За единицу любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (мкмоль/мин). Для выражения активности фермента пользуются удельной и молекулярной активностями. 2) Удельную активность фермента принято выражать числом единиц фер­ментативной активности на 1 мг белка. 3) Число молекул субстрата, подверга­ющихся, превращению одной молекулой фермента в минуту, принято называть числом оборотов, или молекулярной активностью. 4) Предложено новое определение международной единицы фермента, катал (кат), соответствующее количеству фермента, способному вызывать превращение 1 моль субстрата в продукт в 1 сек. (1 моль/с). 1 Е = 16,67 нкат. Удельная активность кат/кг активного белка. Рекомендуется проведение измерений единиц фермента при 25 °С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентра­цию насыщения. В этом случае скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

В клетках микроорганизмов обнаружено более 1000 видов ферментов. В одной клетке содержится около 100000 молекул ферментов. Каждую реакцию в клетке могут катализировать 50-100 молекул соответствующего фермента. Содержание каждого фермента в клетке составляет 0,1-5,0% общего количества белка.

Источники ферментов. Ферменты животного происхождения преимущественно выделяют из органов, в которых протекают интенсивные биохимические процессы. Из слизистой желудка свиней и крупного рогатого скота получают препарат пепсин. Из поджелудочной железы свиней получают смеси трипсина, химитрипсина, липаз и амилаз (гликозидаз). Из желудка телят выделяют сычужный фермент, широко используемый в сыроделии. Из ферментов растительного происхождения наиболее широко в народном хозяйстве используют амилазы и папаин. Условно ферментным препаратом можно назвать и ячменный солод, в котором содержится до 1% амилаз. Растительный протеолитический фермент – папаин – содержится в плодах дынного дерева. В США ежегодно расходуют около 100 т папаина для обработки (тендеризации, т.е. размягчения) мяса. Папаин при комнатной температуре за 2 часа расщепляет белки соединительной ткани (коллаген, эластин); аналогично действуют протеиназы фицин (из фигового дерева) и бромелин (из ананаса). Из растительного сырья получают также фосфатазы (картофель), пероксидазы (хрен), уреазы (Канавалия мечевидная), амилазы (ячмень).

Содержание ферментов в растениях низкое и получение ферментов из растений носит сезонный характер. Органы животных получают на мясокомбинатах, но при этом возникают проблемы с консервированием и хранением этого вида сырья. Перспективно получение ферментов микробиологическим путем. Технологии генетической инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимого фермента. Кроме того, среди микроорганизмов находят формы, живущие в экстремальных условиях (термофилы, галлофилы и др.). Из них выделяют ферменты с улучшенными свойствами – термостабильные, осмоустойчивые, кислото- и щелочеустойчивые. Для биотехнологии важно, что микроорганизмы могут выделять ряд ферментов из клеток в окружающую среду; это делает этапы выделения и очистки ферментов более технологичными.

Абзимы и рибозимы. Идея W.Jencks (1969) о способности белков-антител катализировать химические реакции была подтверждена в конце 80-х годов прошлого века. Были введены термины «каталитические антитела» или «абзимы» (от antibody enzyme). В настоящее время известны несколько классов химических реакций, катализируемых антителами: ацилтрансферазные, изомеразные, бимолекулярной ассоциации и окислительно-восстановительные.

Абзимы могут быть выработаны для катализа почти всехтхимических реакций. Эта уникальная особенность выгодно отличает абзимы от других биологических катализаторов. Потенциальное число таких химических превращений больше, чем количество реакций, имеющих место в живых системах и катализируемых соответствующими ферментами. По мнению И.В.Семак (2006), абзимы могут найти самое широкое применение:

1. В органическом синтезе за счет увеличения специфичности катализа, возможности разделения энантиомеров и катализа трудно идущих химических превращений.

2. В медицине для «совершенствования» системы иммунитета, когда антитела, способны не только связывать, но и катализировать разрушение токсинов, бактерий, раковых клеток и др. При этом в организм вводятся либо готовые абзимы, либо безвредные гаптены, обеспечивающие выработку абзимов с нужной каталитической активностью.

Каталитические РНК (рибозимы) были описаны в 80-х годах прошлого века (T.R.Chech et al., 1981; C.Guerrier-Takada et al., 1983). Рибозимы достаточно широко представлены в природе и играют важную роль в эволюции живых организмов, поскольку они могут обеспечивать репродукцию и процессинг РНК без участия белков-ферментов. В частности, рибозимы участвуют в удалении неинформативных интронов из пре-и-РНК, на этапе синтеза белков путем созревания тРНК с помощью рибонуклеазы Р РНК, а также в процессе саморепликации вирусного РНК генома (патогенные вирусы для растений и человека). Ранее неоднократно сообщалось, что синтез белка в рибосомах зависит от уровня рРНК. Активность рибозимов может контролироваться антибиотиками, что открывает новую страницу в профилактике и лечении вирусных заболеваний, включая вакцинацию.

Иммобилизованные ферменты – это ферменты, сохраняющие свою активность при связывании с нерастворимыми носителями (1971 г., Первая конференция по инженерной энзимологии). Преимущества иммобилизованных ферментов:

- являются гетерогенными катализаторами, легко отделяющимися от реакционной среды;

- возможны направленные изменения свойств фермента;

- долговечность и стабильность ферментативного препарата;

- технологичность применения и экономическая выгода.

Ферменты иммобилизуются двумя способами – без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы – адсорбция ферментов на нерастворимых носителях; иммобилизация фермента путем включения в гель, иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры) или с образованием ковалентной связи между ними (иммобилизация на носителях, обладающих гидроксогруппами – бромциановый метод; обладающих аминогруппами; обладающих активированными производными карбоксильной группы; иммобилизация на носителях со свободными сульфгидрильными группами (через образование дисульфидных связей).

Методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов – индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных культур, комбинированных препаратов. Использование иммобилизированных клеток удобно, поскольку отпадает необходимость выделения, очистки и хранения изолированного фермента.

Согласно Егоровой Т.А. и соавт. (2003), иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения рацемических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммобилизованные хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны – для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей – аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому брожению в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизована и используется для целей инженерной энзимологии примерно десятая часть (преимущественно оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы).

Для осуществления химических процессов с помощью иммобилизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пластинчатые и танкерные реакторы разного объема и производительности. Иммобилизованные ферментные системы функционируют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую протекает среда с субстратом, подлежащим химическому превращению (гетерогенный катализ).

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток:

- получение глюкозофруктозных сиропов;

- получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей;

- синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония;

- синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты;

- синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты;

- получение безлактозного молока;

- получение сахаров из молочной сыворотки;

- получение 6-аминопенициллиновой кислоты.

Высокая эффективность биологических катализаторов и специфичность их действия делают ферменты идеальными реагентами для аналитической химии. Сейчас созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, ферментные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммобилизованные ферменты и клетки и предназначенные для автоматического детектирования продуктов энзиматического превращения. Точность определения достигается за счет специфичности ферментативного определения вещества. Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аффинных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антиген-антитело, агонист (антагонист)-клеточный рецептор, а также на основе полупроводниковых структур и мезоэлектрического эффекта. Последние два биодатчика дают возможность создавать сенсоры, чувствительные к газам. Это имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменение внешних воздействий.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помогают выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагностике заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (инсектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитических задач в химической и микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях.

Важную роль в медицине играют исследования по направленному транспорту лекарственных веществ. Чаще используют инкапсулированные ферменты – протеолипосомы. Протеолипосомы, заполненные ферментом аспарагиназой, переносятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей. Колонки, заполненные микрокапсулами с ферментом, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в десятки раз эффективнее обычного аппарата.

Стабилизация ферментов в биотехнологических системах (по И.В.Семак, 2006). В биотехнологических процессах ферменты, как правило, функционируют при повышенных температурах, экстремальных значениях рН, в присутствии высоких концентраций органических растворителей или поверхностно-активных веществ. В связи с этим возникает проблема стабилизации фермента.

Для стабилизации ферментов используют три основных подхода:

1) в среду, в которой хранится фермент или проводится ферментативная реакция, добавляют стабилизирующие вещества (субстраты или их аналоги, органические растворители и соли);

2) фермент химически модифицируют (часто используют бифункциональные реагенты типа глутарового альдегида, которые способны образовывать поперечные связи между аминогруппами и тем самым сохранять активную конформацию фермента в денатурирующих условиях);

3) фермент иммобилизируют на носителе.

Направленная эволюция ферментов как способ оптимизации биотехнологических свойств ферментов. Направленная эволюция фермента включает этапы:

1) создание библиотеки мутированных генов фермента;

2) экспрессия гена в подходящем микробном хозяине;

3) скрининг или селекция продуктов экспрессии, для которых зафиксировано улучшение желаемого параметра;

4) гены, кодирующие ферменты с улучшенными свойствами, снова подвергают мутагенезу с целью накопления полезных мутаций.

Получение полусинтетических ферментов осуществляют при использовании других ферментов или белков, изначально не обладающих ферментативной активностью. Для этого используют три основных подхода:

1. Ковалентная модификация функциональных групп в активном центре путем присоединения аналогов коэнзима.

2. Удаление кофактора и использование образовавшейся полости в качестве активного центра.

3. Конформационная модификация путем изменения нативной конформации белка под воздействием различных физико-химических факторов с последующей фиксацией индуцированных изменений путем образования внутри- и межмолекулярных сшивок.