Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации

Последовательное поступление генов из Hfr в F ~ -клетки представляет возможность картировать их в бактериальной хромосоме в соответствии с порядком и временем их попадания в клетки. Рассмотрим, например, следующее скрещивание.

Скрещивание 3: Hfr, Thr⁺ Leu⁺ Az^s Tl^s Lac ⁺ Gal ⁺, Str^s x

F ^–, Thr^– Lei ^– Az^RT1^RLac ^– Gа1 ^– Str^R

Продолжительность конъюгации (мин)

Рис. 8.6. Графики зависимости доли неселективных маркеров среди отобранных рекомбинантов типа Thr + Leu + Str в скрещивании 3 от продолжительности конъюгации. После прерывания конъюгации культуру высевают на селективную среду. Экстраполяция графиков для частоты каждого из неселективных маркеров к оси абсцисс дает время от начала конъюгации, по прошествии которого маркер становится способен к рекомбинации с хромосомой F –-клетки.

8. Бактериальный геном 237

Рис. 8.7. Схема, иллюстрирующая полярность переноса Hfrхромосомы в эксперименте с прерванной конъюгацией. К рекомбинации с хромосомой F – -клетки способны лишь те гены Hfr-хромосомы, которые к моменту прекращения конъюгации оказались в реципиентной F – -клетке.

Скрещивание между указанными штаммами начинается со смешивания двух культур в момент времени t = 0. Через последовательные интервалы времени из смеси отбирают пробы и резко взбалтывают их на мешалке с тем, чтобы разрушить конъюгационные трубки, соединяющие скрещивающиеся клетки. Затем образец высевают на агар со стрептомицином, содержащий в качестве источника углерода глюкозу. На этой среде отбираются рекомбинанты Thr ⁺ Leu ⁺ Str^R. Соответствующие три маркера thr ⁺, leu ⁺ и str^R, называются селективными. Гены, обусловливающие чувствительность к азиду (αzi), к фагу Т1 (ton), гены утилизации лактозы (lac) и галактозы (gal) являются в данном случае неселективными маркерами, поскольку среда, на которой выращиваются клетки, не позволяет различать аллели этих локусов у участвующих в скрещиваниях бактерий. Затем отобранные рекомбинанты Thr ⁺ Leu ⁺ Str^R пересевают на различные среды, с тем чтобы определить генотипы этих рекомбинантов по неселективным маркерам. Частота соответствующих аллелей откладывается на графике как функция от про-

238 Организация и передача генетического материала

должительности скрещивания (рис. 8.6). Полученные кривые показывают, что различные неселективные маркеры Hfr становятся способны к рекомбинации с хромосомой F ^– -клеток по истечении различного времени от начала скрещивания (рис. 8.7). Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю указывает время попадания маркера в F ^–клетку (рис. 8.6). Эти данные позволяют упорядочить гены по Hfr хромосоме, начиная от точки интеграции F-фактора, и оценить физические расстояния между ними, измеряя эти расстояния в минутах, прошедших с начала скрещивания.