Экспериментальная часть. Уже сказано, что преобладание углеводородных групп в веществах класса липидов сильно ограничивает их растворимость в воде и разнообразие

Уже сказано, что преобладание углеводородных групп в веществах класса липидов сильно ограничивает их растворимость в воде и разнообразие, характерных для них качественных реакций. Поэтому работу с липидами проводят под тягой, извлекая их из образцов экстракцией, с помощью органических растворителей и их смесей: гексана, метиленхлорида, хлороформа, метанола и др. Посуда для работы с ними, должна быть не только чистой, но градуированной, оснащенной притертыми пробками и абсолютно сухой.

В курсе органической химии изучались реакции выявления карбоксильных групп и двойных связей ВЖК, соответственно с помощью титрования щелочами и галогенпроизводными. Наличие и количество фосфатных групп в фосфо- и сфинголипидах, устанавливают по реакции с молибденовокислым аммонием (см. Занятие 12). Поэтому рассмотрим подробней, лишь работу со стеролами, распространенными у всех эукариот. Как и другие липиды, стеролы, не растворимы в воде, но взаимодействуют с нею (1:100 молекул), образуя стойкие непрозрачные эмульсии.

14.3.1. Качественные реакции со стеролами выполняют в вытяжном шкафу, соблюдая правила работы с органикой и концентрированными кислотами.

1) Принцип пробы Сальковского. Под действием концентрированной серной кислоты, ХС дегидратируется в холестерилен, имеющий красную окраску. Его дальнейшая конденсация в бихолестандиен вызывает флуоресценцию в зелёной области спектра, позволяя обнаружить микроколичества (10^-7 – 10^-9 М/л), например стероидных гормонов в биожидкостях.

Ход работы: 1. Внести в чистую сухую пробирку 0,1-0,2 мл хлороформного экстракта мозга крыс.

2.Осторожно по каплям, добавить такой же объем концентрированной серной кислоты. Перемешать и зарегистрировать окраску.

2) Принцип реакции Либермана – Бурхарда – тот же, что и у предыдущей. Однако, в присутствии уксусного ангидрида, бихолестандиен образует сульфопроизводное зеленого цвета. Эта реакция менее чувствительна (10^-4 – 10^-6 М/л) и применяется для колориметрических методов определения ХС.

Ход работы: 1. В пробирку с 0,1-0,2 мл хлороформного экстракта мозга крыс добавить 3-5 капель уксусного ангидрида и 2-3 капли концентрированной серной кислоты. Содержимое перемешать и через 5 мин, зарегистрировать развитие окраски.

3) Принцип качественной реакции Петтенкофера на желчные кислоты: В присутствии концентрированной серной кислоты, из фруктозы и ее производных возникает гидроксиметилфурфурол, дающий с желчными кислотами пурпурную окраску.

Ход работы: 1. На дно сухой чашки Петри или часового, но не предметного стекла, нанести одну каплю желчи и каплю 20 % раствора сахарозы.

2. Хорошо перемешать их стеклянной палочкой.

3. Не сдвигая с места чашки/стекла, нанести рядом 3 капли концентрированной серной кислоты.

4. Наблюдать через 1-3 мин., в месте контакта капель, развитие красной окраски, при стоянии переходящей в красно-фиолетовую.

14.3.2. Метод определения общего холестерола в биожидкостях, с помощью тест-набора реагентов «Новохол» (ЗАО «Вектор-Бест»)

Меры предосторожности: При работе с кровью людей, считать ее потенциально инфицированной, а потому быть не только в халате, но, желательно, и в одноразовых перчатках.

Реактивы:

1. Калибровочный раствор холестерола - 4,65 ммоль/л

2. Рабочий раствор – смесь лиофильно высушенных Е и реагентов в 0,01 м растворе фосфатного буфера.

Принцип метода (см. схему на рис. 14.6):

Рис. 14.6. Схема последовательности ферментных реакций метода

Ход работы: 1. В соответствии с таблицей разлить в 2 пробирки:

* - В связи с необходимостью экономии калибровочного раствора холестерола, пробу 2 (калибратор) на группу студентов, выполняет лишь одна рабочая пара.

2. Содержимое пробирок тщательно перемешать и выдержать 10 мин в термостате при 37 С.

3. Против рабочего раствора, в кювете толщиной 10 мм со вкладышем, фотометрировать при λ 490 нм – зеленом светофильтре абсорбцию опытной и калибровочной проб.

Расчет концентрации холестерола в пробе вести по формуле:

С – концентрация холестерола;

Ао – абсорбция исследуемой пробы;

Ак – абсорбция калибровочной пробы.

Нормальная концентрация холестерола в сыворотке крови – не более 5,2 ммоль/л.

Вопросы для самоконтроля

14.4.1.Гдевстречаютсявещества классалипидов и зачем их применяют?

14.4.2. Чем объяснить сложности классификации липидов?

14.4.3. Чем и как извлекают липиды из тканей и др. объектов?

14.4.4. Какие методы применяют для разделения липидных смесей?

14.4.5. В чем Вы видите преимуществабиофизического подхода к липидам?

14.4.6. Повозможности, с формулируйте самое точное определение веществ, класса липидов.

14.4.7. Сгруппируйте липидные ассоциаты по их структуре и свойствам.

14.4.8. Что Вы знаете о химической классификации и функциях липидов?

14.4.9. Что вы знаете о структуре, свойствах и функциях высших жирных кислот.

14.4.10. Объясните понятия «иодное число» и «кислотное число» и области их применения.

14.4.11. Объясните происхождение и биологическую роль веществ подкласса эйкозаноидов.

14.4.12. Объясните происхождение и биологическую роль веществ подкласса изопреноидов.

14.4.13. Что Вы знаете о стеролах и их функциях в организме животных.

14.4.14. Какие производные холестерола встречаются у животных и в чем заключаются их функции?

14.4.15. Как обнаружить стеролы в биообъектах?

14.4.16. Нужны ли новорожденным млекопитающим желчные кислоты, если жир молока уже эмульгирован, а секреция липазы происходит в желудке?

14.4.17. Исходя из формул объема сферы – 4/3 πR³ и площади ее поверхности – 4 πR², рассчитайте, насколько снижается объем и возрастает площадь контакта липидных капель с липазой, при том, что диаметр капель пищевого жира ~5 мм, а их эмульгирование желчными кислотами в просвете тонкого кишечника, доводит его до 0,5 мкм.

14.4.18. Что Вы знаете о сходстве и различиях в структуре, свойствах и функциях, подкласса молекул глицеролипидов?

14.4.19. Что такое сфинголипиды и какую биологическую роль они играют?

14.4.20. Расскажите о структуре, свойствах и биологической роли восков.

14.4.21. Что Вам известно о структуре, свойствах и функциях липидных ассоциатов?