Определение концентрации аминотрансферазы АЛТ в сыворотке крови

Определение концентрации аминотрансферазы АСТ в сыворотке крови

Принцип метода: Аспартат-аминотрансфераза (L-аспартат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К. Ф. 2.6.1.1.) катализирует реакция между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Реактивы:

1.эталонный раствор натрий пировиноградной кислоты 2 ммоль/л (3 мл)

2.2,4-динитрофенилгидразин раствор 1 ммоль/л в НCl 1 моль/л (100 мл)

3.натрий гидроокись 1 флакон

4. субстрат АСТ фосфатный буфер 0,1 моль/л, L-аспартат 0,1 моль/л, 2-оксоглутарат 2 ммоль/л (2 ˣ 50 мл)

Вспомогательный реактив(не входит в состав набора): физиологический раствор- 0,9 г хлорида натрия в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление рабочего раствора гидроокиси натрия: в мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3.

Проведение анализа:

• длина волны (500-530) нм

• кювета 1 см

• температура инкубации (37±0,1)^оС

Реактив 4 перед анализом нагревают до (37±0,1)^оС

отмерить	проба	Контрольный р-р
Реактив 4 Физ.р-р	0,25 -	0,25 0,25
Инкубируют в течение 3 мин при 37оС
Сыворотка крови	0,05	-
Инкубируют точно 60 мин при 37оС
Реактив 2	0,25	0,25
Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при (с +15 до +25) оС
Раствор NaOH	2,50	2,50
Перемешивают и спустя 10 мин измеряют оптическую плотность пробы против контрольного раствора (А)

Калибровка

В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления Реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и спустя 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.

Р-р №	Физ. р-р(мл)	Реактив 4 (мл)	Реактив 1 (мл)	Реактив 2 (мл)	Р-р NaOH (мл)	Конечная кат. конц.(мккат/л)
	0,10	0,50	-	0,50	5,00
	0,10	0,45	0,05	0,50	5,00	0,28
	0,10	0,40	0,10	0,50	5,00	0,56
	0,10	0,35	0,15	0,50	5,00	0,83
	0,10	0,30	0,20	0,50	5,00	1,11

Определение концентрации аминотрансферазы АЛТ в сыворотке крови

Принцип метода:Аланин-аминотрансфераза (L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К. Ф. 2.6.1.2.) катализирует реакция между L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты.Определение основана на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Реактивы:

1.эталонный раствор натрий пировиноградной кислоты 2 ммоль/л (3 мл)

2.2,4-динитрофенилгидразин раствор 1 ммоль/л в НCl 1 моль/л (100 мл)

3.натрий гидроокись 1 флакон

4. субстрат АЛТ фосфатный буфер 0,1 моль/л,DL-альфааланин 0,2 моль/л, 2-оксоглутарат 2 ммоль/л (2 ˣ 50 мл)

Вспомогательный реактив (не входит в состав набора) физиологический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление рабочего раствора гидроокиси натрия- в мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3.

Проведение анализа:

• длина волны (500-530)нм

• кювета 1 см

• температура инкубации (37±0,1)^оС

Реактив 4 перед анализом нагревают до (37±0,1)^оС

отмерить	проба	Контрольный р-р
Реактив 4 Физ.р-р	0,25 -	0,25 0,25
Инкубируют в течение 3 мин при 37оС
Сыворотка крови	0,05	-
Инкубируют точно 60 мин при 37оС
Реактив 2	0,25	0,25
Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при (с +15 до +25) оС
Раствор NaOH	2,50	2,50
Перемешивают и спустя 10 мин измеряют оптическую плотность пробы против контрольного раствора (А)

Калибровка

В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления Реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и спустя 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.