Накопительные культуры и принцип элективности

Культура, обогащенная одним определенным видом или определенной физиологической группой микро-мов, наз элективной, накопительной или избирательной. Принцип элективности (метод элективной культуры) — разработан С. Н. Виноградским. Заключается в подборе строго избирательных условий — питательной среды и других факторов — для выделения и культивирования определенных видов микроорганизмов с учетом их природных физиологических особенностей. Метод накопительных культур и в принципе, и на практике очень прост. Для накопления нужны такие условия, при которых данный организм преодолевает конкуренцию остальных. Подбирая ряд факторов (источники энергии, углерода, азота, акцепторы электронов, газовую атмосферу, освещенность, температуру, рН и т.д.), создают определенные условия и инокулируют среду смешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. Наиболее приспособленный к такой среде микроорганизм растет и вытесняет все остальные, сопутствующие организмы. Путем многократных пересевов в такую же жидкую среду и посева на твердую среду того же состава можно без труда выделить преобладающий (накопленный) штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкую предотвращает рост сопутствующих организмов, которые могли бы использовать продукты выделения или даже автолиза клеток первичной культуры. Лучшим материалом для инокуляции служат пробы из тех мест, где уже имеется «естественное обогащение». Метод накопительных культур позволяет выделять микроорганизмы с любой комбинацией потребностей в питательных веществах - если, разумеется, искомый тип вообще существует в природе. Особенно легко создать элективные условия для крайне специализированных микроорганизмов. Например, минеральная среда, не содержащая соединений азота, на свету строго избирательна для цианобактерий, фиксирующих N₂. Если ту же среду дополнить органическим источником энергии и углерода, на ней в темноте в аэробных условиях будет развиваться Azotobacter, а без воздуха- Clostridium. Для успешного получения накопительных культур следует ограничиться удовлетворением минимальных потребностей только того микроорганизма, который хотят выделить. В посевном материале, используемом в эксперименте, могут присутствовать разные штаммы с одинаковым типом метаболизма, отличающиеся друг от друга лишь незначительно, например только по оптимуму рН и по скорости роста. Если для получения накопительной культуры использовать такой материал, то доминировать будет наиболее приспособленный к данным условиям или наиболее быстро растущий штамм; все же остальные будут подавлены, и выделить их не удастся. Поэтому в тех случаях, когда хотят выделить как можно больше штаммов, растущих при определенных селективных условиях, посев следует производить непосредственно в чашки. На твердых элективных средах штаммы, для которых условия благоприятны, образуют отдельные колонии. При достаточно большом расстоянии между колониями конкуренция за питательные вещества не может иметь места: штаммы, растущие более медленно, не подавляются растущими быстрее, так что те и другие могут быть выделены раздельно

19. Методы культивирования микроорганизмов. Периодическое культивирование. Непрерывное культивирование. Сущ 2 системы культивирования микро-мов: закрытая наиболее старая система. В этом случае ни один компонент системы не покидает ее и не поступает извне в процесс культивирования. Периодическая культура – популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве. В этой системе различают: а) стационарную культуру – выращивание в среде до тех пор, пока не получена максимальная биомасса; б) глубинную культуру – рост микро-мов в толще среды. Аэрация среды в этом случае осуществляется путем перемешивания с помощью мешалки, или барбатера – устройства, нагнетающего стерильный воздух; в) анаэробная культура для выращивания строго анаэробных бактерий требует исключения доступа кислорода. Периодическое культивирование можно рассматривать как замкнутую систему, которая в своем развитии проходит несколько фаз. Условия существования бактериальной культуры во всех этих фазах различны. Автоматическое регулирование в такой системе невозможно. Открытая система – непрерывное или проточное культивирование. Метод разработан в 50 г ХХ столетия. Суть: ферментер, где выращивается культура микро-мов, постоянно подается свежая питательная среда и параллельно выводятся продукты обмена и накапливающаяся биомасса микробов. Т. о, в ферментере создаются условия для поддержания бактериальной культуры в состоянии активного размножения на неопределенно долгий период времени. Система хемостата, в которой рост контролируется концентрацией питательного субстрата по источнику углерода или азота. Чем выше концентрация лимитирующего вещ-ва, тем выше скорость роста бактериальной популяции. В системе турбидостата контроль над ростом культуры осуществляется по плотности бактериальной популяции. Фотоэлемент регистрирует плотность культуральной жидкости и ч/з реле регулирует поступление свежей среды в ферментер. Установка легко поддается автоматическому регулированию. Метод непрерывной культуры микро-мов широко внедряется в различные производства микробиологической промышленности, связанные с получением максимальной биомассы микро-мов и на этой основе ценных продуктов микробиологического синтеза. В лабораторной практике метод непрерывной культуры применяется для изучения физиологии прокариот в строго контролируемых условиях. При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный, проточный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.
В зависимости от метода, благодаря которому культура поддерживается в состоянии динамического равновесия (когда μ = D), различают турбидостатный и хемостатный принципы.

20. Разнообразие типов питания у микроорганизм. Особенности метаболизма микроорганизмов. Микроорганизмы, как и все живые существа, нуждаются в пище, которая поступает в клетки из внешней среды. Пищей обычно называют вещества, которые, попав в живой организм, служат либо источником энергии, необходимой для процессов жизнедеятельности, либо материалом для построения составных частей клетки.

Для характеристики типов питания прокариотных организмов используются три критерия: источник углерода, источник энергии и донор электронов(водорода).

По источнику углерода прокариоты являются автотрофами, если они получают углерод в результате фиксации углекислого газа, и гетеротрофами, если источником углерода для них служат органические соединения.

По использованию различных источников энергии микроорганизмы делятся на фототрофы, потребляющие солнечный свет, и хемотрофы, энергетическим материалом для которых служат разнообразные органические и неорганические вещества.

В зависимости от природы окисляемого субстрата, называемого донором электронов, микроорганизмы делят на органотрофы, потребляющие как энергетический источник органические вещества, и литотрофы, обладающие способностью использовать неорганические доноры электронов (H₂, NH₃, CO и т.д.). Только прокариотам свойственно использование энергии окисления неорганических веществ. В зависимости от источника энергии и природы донора электронов, возможно выделение 4 основных типов энергетического метаболизма: хемолитотрофия, хемоорганотрофия, фотолитотрофия, фотоорганотрофия. У хемотрофов электроны от донора в процессе биологического окисления передаются по цепи окислительно-восстановительных реакций в соответствии с термодинамическим градиентом, при этом выделяется свободная энергия. Такие процессы осуществляют прокариоты с бродильным или дыхательным типом энергетики, использующие органические или неорганические субстраты в качестве энергетических ресурсов. У фототрофов использование света как источника энергии требует дополнительного подключения химических соединений в качестве доноров электронов для образования восстановителя.

Учитывая биосинтетические способности организмов, можно выделить 8 типов энергетического и конструктивного метаболизма, которые отражают способы питания или способы существования прокариот.

Типы питания: фотолитоавтотрофия(цианобактерии, большинство пурпурных и зеленых бактерий), фотолитогетеротрофия(некоторые цианобактерии, пурпурные и зеленые бактерии), фотоорганоавтотрофия(некоторые пурпурные бактерии), хемолитоавтотрофия(нитрифицирующие, тионовые, водородные бактерии; ацидофильные железобактерии), хемолитогетеротрофия(метанобразующие архебактерии, водородные бактерии), хемоорганоавтотрофия(факультативные метилотрофы, окисляющие муравьиную кислоту), хемоорганогетеротрофия(большинство прокариот).

Из всех типов питания наиболее широко распространены в живом мире два типа питания – фотолитоавтотрофия и хемоорганогетеротрофия. Первый тип питания присущ высшим растениям, водорослям и ряду бактерий. Второй – характерен для животных, грибов и многих микроорганизмов. Остальные типы питания присущи некоторым группам бактерий, живущим в особых, специфических условиях среды.

Метаболизмом или обменом веществ называется сумма целенаправленных реакций, протекающих под действием ферментных систем клетки, которые регулируются различными внешними и внутренними факторами, и обеспечивающих обмен веществами и энергией между средой обитания и клеткой.

Несмотря на физиологические и морфологические различия между микроорганизмами, обмен веществ в клетке идет тремя основными метаболическими путями:

1. Из внешней среды в клетку поступает энергия либо в виде химической энергии органических веществ, либо в виде энергии солнечного света.

2. Из веществ среды, перенесенных в клетку, собираются «строительные блоки», из которых формируются биополимеры клетки и синтезируются белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты и другие клеточные компоненты.

3. В клетке постоянно происходят синтез и разрушение биомолекул, выполняющих различные специфические функции. Обмен веществ можно рассматривать как сумму двух явлений:

• катаболизма (энергетического обмена), представляющего собой ферментативное расщепление крупных органических молекул с выделением свободной энергии, которая запасается в виде макроэргических связей в молекулах АТФ;

• анаболизма (конструктивного обмена), представляющего собой синтез биополимеров клетки и протекающего с затратой энергии.

Катаболизм и анаболизм – два самостоятельных пути в обмене веществ, хотя отдельные участки их могут быть общими. Такие общие участки, свойственные катаболизму и анаболизму, называются амфиболитическими. Регуляция метаболизма в микробной клетке имеет сложную взаимозависимую систему, которая «включает» и «выключает» определенные ферменты с помощью самых различных факторов: рН среды, концентрации субстратов, некоторых промежуточных и конечных метаболитов и т.д. Изучение путей регуляции определенных продуктов обмена веществ в клетке открывает неограниченные возможности для определения оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами целевых продуктов.

21. Анаболизм, амфиболизм и катаболизм: значение и взаимосвязь. Проникновение в клетку экзогенных веществ. Метаболизм и метаболические пути. Как во время роста, так и в состоя­нии покоя вегетативные клетки нуждаются в постоянном притоке энер­гии. Живая клетка представляет собой высокоорганизованную материю. Энергия необходима не только для создания такой организации, но и для ее поддержания. Эту энергию организм получает в процессе обме­на веществ, или метаболизма, т.е. путем регулируемых превращений, которым различные вещества подвергаются внутри клеток. Источника­ми энергии служат питательные вещества, поступающие из внешней среды. В клетках эти вещества претерпевают ряд изменений в результа­те последовательных ферментативных реакций, образующих этапы определенных метаболических путей. Такие пути выполняют две главные функции: они, во-первых, поставляют материалы-предшествен­ники для построения клеточных компонентов и, во-вторых, обеспечи­вают энергию для клеточных синтезов и других процессов, требующих затраты энергии.

Превращения веществ в клетке (обмен веществ, или метаболизм),в результате которых из сравнительно простых предшественников, на­пример глюкозы, жирных кислот с длинной цепью или ароматичерких соединений, образуется новое клеточное вещество, можно ради про­стоты подразделить на три основные группы.

1.Сначала питательные ве­щества расщепляются на небольшие фрагменты (распад, или катабо­лизм),

2.а затем в ходе реакций промежуточного обмена, или амфиболизма, они превращаются в ряд органических кислот и фосфорных эфиров.

Эти два пути переходят незаметно один в другой.

3.Многообразные низкомо­лекулярные соединения-это тот субстрат, из которого синтезируются основные строительные блоки клетки. «Строительными блоками» мы называем аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, фосфорилированные сахара, органические кислоты и другие метаболиты — конечные продукты цепей биосинтеза, иногда длинных. Из них строятся полимерные макромолекулы (нуклеиновые кислоты, белки, резервные вещества, компоненты клеточной стенки и т.п.), из которых состоит клетка. Эти два этапа биосинтеза клеточных веществ - синтез строи­тельных блоков и синтез полимеров-составляют синтетическую ветвь метаболизма, или анаболизм.

Все эти процессы связаны друг с другом напрямую. Один вытекает из другого. Катаболизм есть энергетический обмен, при котором осуществляется расщепление в-в. Анаболизм – пластический обмен, в котором продукты распада катаболизма используются для строительства структур клетки.А амфиболизм есть переходный этап между катаболизмом и анаболизмом, если в катаболизма происходит распад, то в амфиболизме происходит превращение распавшихся в-в в орг в-ва,которые составят структурные компоненты – макромолекулы,которые будут использованы в анаболизме.

22. Взаимоотношения микроорганизмов с животными и растениями. Нормальная микрофлора тела человека. Дисбактериоз.