Транспортная полужидкая среда

К 100 мл перевар Хоттингера или мясопептонного бульона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 ° С 30 мин, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2% теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложное транспортное среду Эмес (AMIES), модифицированное Стюартом. Посев от одного больного производят на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть изучаемый материал из кожи, глаза, уши и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя сеять материал от нескольких больных на одну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин. При посеве исследуемого материала втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2x1 см, затем аналогично на кровяно-телуритовому агаре (или среде Клауберга II), при этом тампон все время поворачивают, чтобы засеять из него весь материал. Затем тем же тампоном штрихами засевают остальные поверхности среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяны чашки или пробирки с транспортным средой инкубируют в термостате при 37 ° С в течение 20-24 час. На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах, делают повторный забор материала. Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно не проводить. Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1-2 мм. Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие жесткие R-колонии. На кровяно-телуритових средах KonomiC.diphtheriae через 24 часа роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 ч они приобретают темно-серого или черного цвета с металлическим блеском, равными или слегка фестончатыми краями, гладкой или с радиально исполосовано поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей. По структуре 48-часовых колоний на телуритових средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии выделяют четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Биовар gravis обычно образует серые или черные матовые сухие колонии, хрупкие, плоские, гладкие, диаметром 1,5-2 мм, с радиально исполосовано поверхностью, он высокотоксичный, не вызывает гемолиза, разлагает крахмал и гликоген. Биовары mitis и belfanti растут в виде серых или черных, круглых гладких выпуклых колоний с ровными краями, диаметром 1-1,5 мм эти варианты менее токсичны, вызывают гемолиз, но не разлагают крахмал и гликоген. Биовар intermedius образует мелкие, серые, прозрачные колонии диаметром 0,5-1 мм, с плоской гладкой поверхностью, он слаботоксичный, не расщепляет крахмала и гликогена. Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных колоний готовят мазки. При обнаружении в них споровых палочек, кокков, дрожжей и др.., Исследования на дифтерию прекращают и дают отрицательный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное местоположение. При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации. Токсигенные свойства исследуют не менее в 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженные петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее до окончания лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности С. diphtheriae, необходимо при множественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте всего одной колонии, ее засевают на среду для определения токсигенности и, прокаливая петлю, - в пробирку со средой Пизу. Если использовали транспортную среду, висел из него делают в плотные кровяно-теллурита среды. На третий день, при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и положительной пробе на цистиназу, выделенную культуру определяют как токсигенные С. diphtheriae. Если линии преципитации через 24 часа отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае отрицательной пробы Пизу культуру идентифицируют как вид коринебактерий. Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратредуктазы. На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенную культуру. Используют такие методы идентификации коринебактерий.