Фер-тыФакторы, влияющие на результаты определения активности ферментов в биологических жидкостях

Ферменты представляют собой сложные биомакромолекулы, обладающие каталитическими свойствами. Активность ферментов зависит от многих факторов. На результаты её определения влияют:• химическая природа субстратов, буферных веществ, стабилизаторов и других соединений, используемых в наборах для определения активности;• степень очистки вышеперечисленных соединений от примесей;• концентрация субстратов, буферных и других веществ в рабочем растворе;• условия проведения анализа (количество образца сыворотки, температура, время проведения реакции) и другие факторы. 1 Рассмотрим влияние, используя анализ активности щелочной фосфатазы (ЩФ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ). Степень очистки субстратов, используемых в диагностических наборах, должна быть не менее 98 %. Примеси, содержащиеся в препаратах субстратов, могут влиять на активность ферментов, могут снижать точность измерений.. Концентрация субстрата — один из наиболее важных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции. Концентрация субстрата, при которой достигается максимальная скорость реакции, называется насыщающей концентрацией. При снижении концентрации субстрата в реакционной смеси скорость реакции также снижается. Концентрации субстрата выше насыщающей могут привести к ингибированию фермента и снижению скорости ферментативной реакции.Таким образом, определение активности ферментов нужно проводить при насыщающей концентрации субстрата. 2. Природа буферного соединения влияет на скорость ферментативной реакции. Например, ион фосфата ингибирует активность ЩФ. Наибольшая скорость гидролиза субстратов ЩФ достигается в диэтаноламиновом буфере. Буферные соединения, используемые в наборах, должны иметь квалификацию “чда” или “хч”, т.к. примеси ионов металлов могут как ингибировать, так и активировать многие ферменты.. Концентрация буферного соединения влияет на конформацию фермента в растворе и должна быть оптимальной для каждого фермента.Ферменты чрезвычайно чувствительны к изменениям рН среды. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН раствора, при котором превращение субстрата происходит с максимальной скоростью. т.д. Небольшие отклонения от оптимального значения рН могут вызвать уменьшение активности фермента в несколько раз.3. Влияние активаторов и стабилизаторов Вкачестве активаторов ферментов в диагностических наборах используют ионы металлов или органические соединения. В качестве стабилизаторов используют белки и их гидролизаты, полиэтиленгликоль, сахара, декстран и другие соединения. Как правило, в инструкциях по использованию наборов не указывают состав и количество добавленных стабилизаторов. Поэтому результаты определения активности ферментов наборами различных фирм, могут значительно отличаться. 4. Влияние концентрации фермента (сыворотки) в реакционной смеси. Для большинства очищенных ферментов скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента в реакционной смеси. При уменьшении их концентрации в реакционной смеси скорость реакции не снижается пропорционально. Это связано со сложными структурными перестройками в молекулах ферментов при разбавлении. Очень важно точно соблюдать дозировку сыворотки, указанную в инструкции, и отбор образца сыворотки проводить поверенной автоматической пипеткой. 5. Влияние температуры на результаты определения активности ферментовУстановлено, что скорость ферментативных реакций при изменении температуры инкубации на 10 °С изменяется в 2 раза. Определение активности ферментов необходимо всегда проводить при температуре, указанной в инструкции по использованию набора.Таким образом, для получения воспроизводимых и сопоставимых данных при определении активности ферментов в биологических жидкостях необходимо учитывать всё многообразие факторов, влияющих на активность ферментов.