Занятие I. БИОМЕМБРАНЫ

Работа 1. Избирательная проницаемость клеточных мембран. Стойкий и временный плазмолиз

Контрольные вопросы:

1. Приведите уравнение водного потенциала клетки (Ψ_кл.), охарактеризуйте его составляющие.

2. Опишите растительную клетку как осмотическую систему. Рассмотрите случай, когда клетка находится в чистой воде. Какие явления наблюдаются при погружении клетки в раствор высокой осмолярности?

3. Как изменяется соотношение между водным потенциалом, потенциалом давления и осмотическим потенциалом клетки по мере увеличения концентрации осмотика?

4. Назовите формы плазмолиза. Объясните, почему в гипертонических растворах одних солей развивается стойкий плазмолиз, а в других – плазмолиз является временным.

5. Вспомните технику приготовления временных микропрепаратов в ботанических исследованиях. Используйте эти навыки в предложенной работе.

Растительную клетку можно рассматривать как осмотическую систему, в которой полупроницаемой мембраной являются плазмалемма и тонопласт, а осмотическим пространством – центральная вакуоль с большой концентрацией осмотически активных веществ (сахаров, органических кислот, солей). Клеточная стенка обладает определенной эластичностью и может растягиваться. Водный потенциал клетки (Ψ_кл.)является алгебраической суммой двух составляющих – осмотического потенциала (Ψ_s) и потенциала давления (Ψ_р): Ψ_кл. = Ψ_s + Ψ_р.

Направление движения воды из наружной среды в клетку и обратно определяется направлением градиентов водного потенциала. При погружении клетки в гипертонический раствор (Ψ_кл. > Ψ_р-ра) вода выходит из клетки, при этом вакуоль уменьшается в объеме и протопласт отстает от клеточной стенки – наблюдается явление плазмолиза. При плазмолизе Ψ_р = 0 и Ψ_кл. = Ψ_S. Плазмолиз может иметь разные формы, сменяющие одна другую: уголковый, вогнутый, выпуклый. Погружение плазмолизированной клетки в воду приводит к осмотическому притоку воды в вакуоль – развивается деплазмолиз. При этом вода поступает в клетку до тех пор, пока Ψ_{s кл.} не будет уравновешен Ψ_р (- Ψ_s = Ψ_р и Ψ_кл. = 0).

Растительная клетка обладает избирательной проницаемостью и для растворенных веществ. Если вещества проходят через мембрану, но медленнее, чем молекулы воды, то плазмолиз с течением времени исчезает (временный плазмолиз). Растворенное вещество постепенно проникает в клетку, уменьшается Ψ_s вакуолярного сока, и вода начинает поступать в клетку – развивается деплазмолиз. Стойкий плазмолиз развивается в гипертонических растворах веществ, для которых клеточные мембраны непроницаемы (малопроницаемы).

Цель работы: сравнить проницаемость клеточных мембран для различных веществ; рассмотреть растительную клетку как осмотическую систему.

Объекты: побег элодеи, луковица репчатого лука.

Реактивы и оборудование: 1 M р-р сахарозы, 1 M р-р карбамида, дистиллированная вода в капельницах; препаровальный набор, микроскоп, секундомер.

Ход работы

1. Приготовить три микропрепарата листа элодеи (эпидермы с выпуклой стороны чешуи луковицы): один – в 1 M растворе сахарозы; другой – в 1 M растворе карбамида; третий, контрольный, – в воде.

2. При малом увеличении микроскопа (15^ок. x 8^об.) найти на микропрепаратах 1 и 2 участки листа (среза), в которых хорошо видны плазмолизированные клетки. Сравнить микроскопическую картину на всех трех микропрепаратах. Рассмотреть микропрепараты при большом увеличении (15^ок. x 40^об.), сделать рисунки.

3. Через 30-60 минут вновь рассмотреть препараты, зарисовать клетки.

В каком растворе плазмолиз сохранился (стойкий плазмолиз)? В каком растворе произошел деплазмолиз (и, следовательно, плазмолиз был временным)? Объяснить наблюдаемые явления.

Оформление работы: рисунками (фотографиями) покажите динамику микроскопической картины на препаратах. Укажите, в каком растворе плазмолиз сохранился (стойкий плазмолиз), а в каком растворе произошел деплазмолиз (и, следовательно, плазмолиз был временным). Зарисуйте (или сфотографируйте) клетки с разными формами плазмолиза. Объясните наблюдаемые явления.

Результаты и обсуждение:

Работа 2. Определение жизнеспособности растительных клеток

Контрольные вопросы:

1. Дайте общую характеристику клеточных мембран (Химический состав, функции, жидкостно-мозаичная модель строения).

2. Какими особенностями состава и структуры обладает плазматическая мембрана растительной клетки? В чем заключаются общие с другими мембранами функции плазмалеммы.

3. Назовите методы определения жизнеспособности растительных клеток, на чем они основаны?

4. Почему наличие плазмолиза у клеток в гипертонических растворах является надежным критерием их жизнеспособности?

Состояние клеток можно определить по их способности к плазмолизу в гипертонических растворах, по движению цитоплазмы, окрашиванием витальными (прижизненными) красителями, выявлением ферментативной активности.

Одним из способов изучения проницаемости клеточных мембран является окрашивание клеток катионными (основными) красителями. Так, нейтральный красный проникает в живую клетку в молекулярной форме, но под влиянием кислой среды вакуоли переходит в ионную форму и, поскольку мембраны непроницаемы для этих ионов, накапливается в вакуоли, окрашивая клеточный сок в малиновый цвет. В поврежденных и мертвых клетках мембраны утрачивают селективность – становятся идеально проницаемыми, повышается сродство к красителю у цитоплазмы и ядра, поэтому вся клетка диффузно окрашивается в желто-бурый цвет. Нейтральный красный – двухцветный индикатор: в кислой среде он имеет малиновую окраску, а в щелочной – желтую.

Цель работы: ознакомиться с методами выявления состояния растительных клеток.

Объекты: луковица лука репчатого, проростки пшеницы, кукурузы, почки с побегов

деревьев.

Реактивы и оборудование: 0,01% р-р нейтрального красного и 1 M р-р KNO₃ в капельницах; препаровальный набор, микроскоп, бюксы, стакан с водой, спиртовка.

Ход работы

1. На вогнутой поверхности чешуи луковицы лезвием сделать надрезы в виде небольших квадратиков (0,5 x 0,5 см). 2-3 квадратика эпидермы снять с чешуи и поместить в бюкс с раствором нейтрального красного.

2. Через 10 минут срезы из бюкса перенести в стаканчик с водой.

3. Отмытые срезы поместить в каплю раствора KNO₃ на предметном стекле, закрыть покровным стеклом и рассмотреть сначала при малом, а затем при большом увеличении микроскопа.

4. Зарисовать клетку. Обратить внимание на окраску клеточной стенки, цитоплазмы. вакуоли. Плазмолизируются ли клетки среза?

5. 2-3 среза поместить в большую каплю воды на предметном стекле и осторожно нагреть над пламенем спиртовки до появления пузырьков. После этого с убитыми кипячением клетками провести операции, описанные в пунктах 1-4.

6. Сравнить и объяснить результаты обоих опытов.

Оформление работы:

Зарисуйте (или приложите фотографии) живые и мертвые клетки после окрашивания и пребывания в растворе осмотика. Сравните и объясните результаты обоих опытов.

Результаты и обсуждение:

Работа 3. Выявление живых и мертвых клеток по ферментативной активности

Соли тетразолия в окисленном состоянии бесцветны, а в восстановленном имеют окраску – красную, синюю, фиолетовую. Восстановление солей тетразолия до окрашенных формазанов происходит с участием ферментов дегидрогеназ живых клеток. В мертвых клетках дегидрогеназы неактивны, поэтому соли тетразолия не восстанавливаются и окраска не развивается.

Цель работы: определить жизнеспособность клеток растительных тканей по активности ферментов дегидрогеназ в реакции восстановления ТТХ.

Объекты: наклюнувшиеся зерновки ячменя, кукурузы, пшеницы; проростки подсолнечника, фасоли, огурцов; почки древесных растений.

Реактивы и оборудование: 0,3% раствор трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) в 0,87% растворе K₂HPO_4, дистиллированная вода; препаровальный набор, бюксы; микроскоп, термостат, спиртовка.

Ход работы:

1. С выбранных объектов (зародыши наклюнувшихся семян, стеблевые апексы проростков, почки) сделать срезы. Можно использовать кончики корней длиной 2-3 мм.

2. Часть срезов положить на предметное стекло в воду и нагреть над пламенем спиртовки.

3. Живые и мертвые срезы поместить в бюксы с раствором ТТХ и выдержать в термостате при температуре 30 – 35⁰С 20 – 30 минут.

4. Сравнить окраску срезов. В каких тканях развивается наиболее яркое окрашивание? Зарисовать и объяснить наблюдаемую картину.

Оформление работы: сравните окраску срезов обоих вариантов, объясните. Отметьте, в каких тканях жизнеспособных объектов развивается наиболее яркое окрашивание. Используйте цветные карандаши при работе с приведенными ниже схематическими рисунками проростков различных растений.

Результаты и обсуждение:

Вариант 1 (живые объекты):

Фасоль пшеница горох кукуруза корень (увел.) подсолнечник

ЗАНЯТИЕ II. «ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ. СВОЙСТВА ЦИТОПЛАЗМЫ»

Работа 1. Определение скорости движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

Контрольные вопросы:

1. Каково биологическое значение движения цитоплазмы в растительных клетках.

2. Назовите и опишите типы движения цитоплазмы в клетках растений, приведите конкретные примеры объектов с указанным типом движения цитоплазмы.

3. Укажите факты, свидетельствующие об энергозависимости процесса движения цитоплазмы.

4. Охарактеризуйте строение микрофиламентов и микротрубочек цитоскелета. Какие функции выполняет цитоскелет клетки?

Движение цитоплазмы – распространенное и легко обнаруживаемое в живых клетках явление. Оно играет важную роль в переносе и распределении веществ в клетке, в поглощении и выделении веществ путем эндо-и эктоцитоза, в реакции раздражимости. Хорошо заметное движение цитоплазмы можно наблюдать в клетках междоузлий харовых водорослей, в клетках морских сифоновых, зеленых водорослей, ксантофитов, листьях элодеи, валлиснерии. Выделяют несколько типов движения цитоплазмы: колебательное, ротационное, циркуляционное, фонтанирующее, челночное. Движение цитоплазмы обусловлено цитоскелетом клетки. Скорость движения можно использовать для оценки уровня жизнедеятельности клетки.

Различные химические агенты, механическое воздействие, свет, температура либо ускоряют, либо замедляют и останавливают движение. Источником энергии для движения цитоплазмы, как и для большинства других физиологических процессов, служит АТФ, образующийся в процессах окислительного фосфорилирования и фотофосфорилирования. Различные ингибиторы и разобщители дыхания (динитрофенол – ДНФ, антибиотик олигомицин) тормозят движение цитоплазмы, что также свидетельствует об энергозависимости процесса.

Скорость движения цитоплазмы можно измерить под микроскопом по перемещению хлоропластов.

Цель работы:

показать, что скорость движения цитоплазмы неразрывно связана с уровнем жизнедеятельности клетки, с затратой энергии.

Объект: побег элодеи с верхушечной почкой

Реактивы и оборудование: микроскоп, объект-микрометр, окуляр со шкалой, препаровальный набор, стаканчик на 50 мл с водой, биологический термостат, секундомер, настольная лампа мощностью 100 Вт; 5·10^-3М АТФ, 5·10^-4М ДНФ в капельницах.

Ход работы:

1. Отделить лист элодеи вблизи верхушечной почки, положить на предметное стекло в каплю воды, закрыть покровным стеклом.

2. Препарат рассмотреть при малом увеличении микроскопа, выбрать наиболее легко просматриваемые участки вблизи центральной жилки. Следить за движением цитоплазмы по перемещению хлоропластов сначала при малом, а затем при среднем увеличении объектива микроскопа (15^ок.´40^об.).

3. Определить скорость движения хлоропластов, измеряя путь, который проходит органелла в единицу времени, используя шкалу окуляра микроскопа (окулярную линейку):

а) вращая окуляр и перемещая препарат на столике микроскопа совместить шкалу окуляра с направлением движения хлоропластов;

б) включить секундомер в момент, когда изображение перемещающегося хлоропласта совместится с выбранным для начала отсчета делением шкалы окуляра. В конце измеряемого линейного отрезка пути в момент совмещения изображения хлоропласта выключить секундомер. Найти разность между двумя выбранными делениями шкалы окуляра;

в) зная цену деления шкалы окуляра при заданном увеличении микроскопа и количество делений шкалы принятое при определении, рассчитать расстояние, пройденное органеллой (мкм);

г) рассчитать скорость движения хлоропласта (V) в мкм/сек, зная путь, пройденный органеллой за время t^".

Подсчет провести для 10 хлоропластов в 10 клетках и полученные данные статистически обработать (Справочные материалы «Первичная статистическая обработка данных эксперимента»).

Поместить каплю раствора АТФ с одной стороны покровного стекла и одновременно оттянуть полоской фильтровальной бумаги воду из-под стекла с другой стороны. Когда лист окажется в растворе АТФ, определить скорость движения цитоплазмы (см. пункт 3).

4. В следующем опыте определить скорость движения цитоплазмы, сменив воду под покровным стеклом на раствор ДНФ.

5. Веточку элодеи опустить в стакан с водой, который находился в термостате при температуре 37°С, оставить там на 20 мин. Затем приготовить препарат и определить скорость движения цитоплазмы по принятой методике.

6. Для выяснения влияния света на скорость движения цитоплазмы в клетках листа элодеи, выдержать побег элодеи в течение 15-20 минут под светом электролампы. Лампа должна быть удалена от растения на 20 - 30 см, чтобы исключить перегрев.

Оформление работы: данные занесите в таблицы. Рассчитайте достоверность разницы (используя критерий Стьюдента) по показателю между контрольным и опытными вариантами. Обсудите влияние различных факторов на скорость движения цитоплазмы в клетках.

Результаты и обсуждение:

Таблица 1

Определение скорости движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

Вариант	Повтор-ность	Цена деления шкалы окуляра, мкм	Длина отрезка пути	Время, сек.	Скорость движения хлоропласта, мкм/сек.
делений шкалы окуляра	мкм
	-	-	-	-

Таблица 2

Влияние внешних факторов на скорость движения цитоплазмы в клетках листа элодеи

Вариант опыта	Скорость движения хлоропластов (V), мм/мин
	S		tф	достоверность разницы
1. Вода, 20°С (контроль)
2. Вода, 37°С
3. 5·10-3М АТФ
4. 5·10-4М ДНФ
5. Вода, 20°С, свет

Работа 2. Влияние различных факторов на степень повреждения растительной ткани

Клеточные мембраны обладают избирательной проницаемостью. Под влиянием различных повреждающих факторов физической, химической, биологической природы происходит изменение проницаемости мембран и диффузия различных веществ из клетки во внешнюю среду. О степени изменения клеточной проницаемости можно судить по количеству выделенных в инкубационную среду веществ (пигментов, электролитов).

Цель работы: провести диагностику степени повреждения растительных клеток по изменению их проницаемости.

Объект: корнеплод столовой свеклы.

Реактивы и оборудование: 1М KNO₃, 30% СН₃СООН, 50% С₂Н₅ОН, дистиллированная вода; КФК, микроскоп, эл. плитка; пробочные сверла (d= 0,6-0,7 см), пробирки, пробки, градуированные пипетки на 10 мл, кристаллизатор, препаровальный набор.

Ход работы: 1. Из корнеплода столовой свеклы высечь пробочным сверлом 5 цилиндриков ткани одинаковой длины (3-4 см).

2. Кусочки ткани тщательно промыть в кристаллизаторе под струей водопроводной воды для удаления механически поврежденных клеток, ополоснуть дистиллированной водой и поместить по одному в пять пробирок, содержащих по 10 мл различных растворов (согласно схеме опыта).

Схема опыта:

I. Вариант. Контроль (дистиллированная вода).

II. Вариант. Кипячение (цилиндрик ткани погрузить на 2 мин в колбу с кипящей водой, после чего охладить и перенести в пробирку с дистиллированной водой).

III. Вариант. Хлороформ (к 10 мл дистиллированной воды в пробирке добавить 6 капель хлороформа и перемешать).

IV. Вариант. Уксусная кислота – 30%-ный раствор.

V. Вариант. Этанол 50% -ный раствор

Пробирки закрыть пробками и оставить в штативе на 30 мин.

3. После экспозиции все пробирки тщательно встряхнуть и слить из них растворы в чистые пробирки.

4. Измерить оптическую плотность инкубационной среды во всех вариантах на КФК-2 при длине волны 440 нм (контрольную кювету заполнять соответствующим раствором сравнения).

5. Из средней части цилиндрических высечек ткани сделать тонкие срезы и приготовить микропрепараты в капле 1М раствора KNO₃. Микропрепараты рассмотреть под микроскопом, сравнить количество плазмолизированных (живых) клеток в контрольном и опытных вариантах.

Оформление работы: заполните таблицу. Постройте диаграмму, отражающую значение оптической плотности среды инкубации в вариантах опыта. Желательно сделать рисунки (фотографии) микроскопической картины с препаратов. Сравните повреждающий эффект различных факторов на ткани объекта.

Результаты и обсуждение:

Таблица 1