Лабораторная диагностика холеры

Знать:

1. Материал для исследования

2. Способы сбора материала

3. Основные методы исследования

4. Ход исследования с идентификацией чистой культуры

Уметь:

1. Провести забор исследуемого материала и доставка его в лабораторию

2. Провести регистрацию и кодирование исследуемого материала

3. Приготовление питательной среды для первичного посева и для изучения ферментативной активности

4. Выделение чистой культуры и провести ее идентификацию

Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, секреторный материал, пищевые продукты, вода, смыв с объекта внешней среды.

Способы сбора материала:

1. Испражнения — последняя вышедшая порция после естественной дефекации. 10-20 мл переносят в стерильные стеклянные баночки с закрывающимися пробками. Сверху пробку обвязывают двойным слоем вощеной бумаги. Этикетируют баночки до внесения вних материала. Материал можно собирать резиновым катетером, ректальной петлей.

2. Рвотные массы — 10-15г. собирают стерильной ложечкой, перемещают в широкогорлую баночку.

3. Секреторный материал — отрезки верхней, средней, нижней части тонкого кишечника. Участки вырезают между двойничными лигатурами с содержимым, помещают в стерильную баночку.

При массовых обследованиях по эпидпоказаниям для выявления носительства можно делать групповые посевы. Материал от 4-5 обследуемых засевают в одну колбу с 100 мл с 1% пептонной водой. Исследования ведут как один анализ. При положительном ответе материал снова берут от этих обследуемых и исследуют индивидуально.

Для забора материала используют стерильную посуду, хорошо закрывающуюся крышками или пробирками, проверенная на целостность, заранее экитированную.

Забор проводят в спец. одежде: халат, резиновый фартук, резиновые перчатки, маска, шапочка.

После забора материала пробки посуды хорошо обвязывают вощеной бумагой, помещают в металлическую посуду — бикс, контейнер. Прилагается сопроводительный документ с указанием предполагаемого диагноза, времени и места взятия его, фамилия собиравшего материал.

Доставка в бак. лабораторию спец. транспортом в кратчайший срок.

В бак. лаборатории поступивший материал регистрируется, т. е. данные сопроводительного документа переносят в регистрационный журнал и под номером запись идет на дальнейшее исследование.

Методы исследования:

1. Бактериологический

2. Микроскопический

3. Серологический

4. Ускоренные методы диагностики:

а) реакция иммобилизации

б) РИФ

Исследование проводят поэтапно. Посевы на жидкие среды проводят через 6-8 часов, а на плотные через 12-18 часов. Бак. лаборатория переходит на круглосуточный режим работы.

Семейство: Vibrionaceae, род: Vibrio (холероподобные), вид: V. Cholerae, биовары: v. Коха, v. Эль-Тор.

Микроскопический метод: окраска по Граму и Цилю-Нильсену, фиксация смесью Никифорова 15-20 минут.

Экспресс-метод: метод иммобилизации с холерной сывороткой и холерными фагами. Ответ через 3-5 минут.

РИФ: ответ через 1-2 часа. Ярко-желтое свечение в виде блестящего ободка по периферии клетки.

Бактериологический метод:

Первый этап:

1. Посев на 1% ПВ (с теллуритом К) из расчета 0,5-1 мл исследуемого материала на 50-100 1% ПВ.

2. Посев на плотные среды: TCBS, ЩА — петлей. Термостатирование при 37 градусах Цельсия.

Второй этап:

3. Через 6 часов изучение роста на ПВ — вибрионы формируют нежную голубоватую пленку.

4. Наличие вибрионов определяется микроскопически: из пленки готовят препараты, окрашиваем по Граму и Цилю-Нильсену — видим Гр- палочки в виде зяпятой, расположенные «стайкой рыб».

5. Предварительные тесты для дифференциации холерного вибриона от холероподобных: ОРА с OI — холерной сывороткой; реакция с поливалентным холерным фагом.

6. Пересев материала пленки на TCBS, ЩА и на II-ую ПВ при 37 градусах.

Третий этап:

7. Через 12-16 часов изучение роста на TCBS — колонии в S-форме, мелкие, желтые. На ЩА — в S-форме «капельки росы».

8. С подозрительными колониями ставятся тесты:

а) На оксидазу. На изолированную колонию наносим капли реактива и через 1-2 минуты колония синеет. Оксидаза присутствует у холерных вибрионов — у холероподобных отсутствует.

б) Постановка ОРА с IO — холерной сывороткой.

в) Постановка ОРА с типовыми сыворотками Огава, Инаба.

На основании положительной оксидазной пробы и ОРА, при микроскопии — Гр- палочки в виде запятой, выдается приблизительный ответ.

9. Подозрительные колонии пересеваются на полеуглеводную среду — ПУС для выделения чистой культуры.

Четвертый этап:

10. Через 12 часов изучение роста на ПУС: сахароза и лактоза расщепляется до кислоты.

11. Постановка с чистой культурой дифференцирующих тестов:

а) Тесты родо-видовой принадлежности (V.cholerae). Определение группы Хейберга — посев на маннозу, сахарозу, арабинозу. Учет через 14 часов: манноза, сахароза, арабиноза расщепляется до кислоты. Определение диастазы — посев на среду Кодама с крахмалом. Через 14 часов к среде добавить йод. Посинения не произойдет, т. к. диастаза разрушила крахмал. У холерных вибрионов диастаза присутствует.

б) Тесты для определения биовара. Определение гемолитических свойств: к 1 мл бульонной культуры добавить 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Термостатирование 2 часа при 37 градусах Цельсия.

Учет:

Гемолизин положительно: в пробирке «лаковая кровь» - культура Эль-Тор.

Гемолизин отрицательно: в пробирке осадок эритроцитов, культура классического вибриона Коха.

Определение чувствительности к полимиксину: к питательной среде добавить 50 Ед на 1 мл среды. Посев исследуемой культуры. Учет через 8-10 часов.

Рост есть — культура не чувствительно к полимексину — биовар Эль-Тор.

Роста нет — культура чувствительна к полимексину — биовар Коха.

Реакция Фогеса-Проскауэра (RWP) посев на фосфатно-буферный бульон Кларка с глицерином. Через 2 суток к бульону добавить 0,6 мл А-нафтола и 0,2 мл 40% NaOH. Появление малинового окрашивания свидетельствует о накоплении в среде ацетилметилкарбинола. Малиновое окрашивание — Эль-Тор; отсутствие окрашивания — Коха.

Определение фаговара: используется чашка Петри с перегородкой. В оба сектора вносят щелочной агар и засевают исследуемую культуру. После подсушивания на один сектор наносят каплю фага с мукерджи IV типа, на другой сектор — фаг Эль-Тор. Учет через 14-16 часов. Если лизис культуры фагом с мукерджи IV типа наличие «стерильного пятна», то культура Коха. Если лизис культуры под влиянием фага Эль-Тор, то биовар Эль-Тор.

Питательные среды

1. 1% пептоновая вода — к 1 литру дистиллированной воды добавить 10 грамм пептона, 5 грамм NaCl, 0,1 грамма нитрата калия и карбонат натрия до установления pH 9,0. Разлить во флаконы, пробирки. Стерилизовать в автоклаве 20 минут при 120 градусах.

2. Щелочной агар — к 1 литру МПА добавить 30 мл 10% раствора карбоната натрия, кипятить 45 минут. Установить pH 8,0-9,0. Разлить во флаконы, пробирки. Стерилизовать в автоклаве 20 минут при 120 градусах.

3. Среда Кларка — 5 грамм двузамещенного фосфата калия, 5 грамм пептона, 5 грамм глюкозы. Растворить в 1 литре дистиллированной воды. Довести до кипения, профильтровать, разлить в пробирки. Стерилизовать при 0,5 атм. 30 минут.

4. Сестра TCBS — сухая среда — pH 8,6. Выпускается фирмой Дифко (США).

Дополнительные исследования:

1. Определение антигена возбудителя в исследуемом материале с помощью ДНК.

2. Серологический метод:

а) Выявление переболевших

б) Определение напряженности иммунитета у вакцинированных