Лабораторные методы аллергодиагностики

Эти методы могут широко использоваться при аллергических заболеваниях в фазе обострения, в период массивного контакта с аллергеном, при высокой чувствительности заболевших к аллергену, при наличии противопоказаний, у детей, при идентификации профессиональных аллергических заболеваний, так как исключают возможность появления неспецифических, ложноаллергических реакций.

К методам, выявляющим аллергические реакции немедленного, В-зависимого типа, относятся:

а) определение общего IgE (однако, его высокий уровень может быть и в продуктивной фазе иммунного ответа),

б) определение аллерген-специфических IgE и IgG4.

Уровень IgE иIgG4 определяются методом ИФА (см.лаб.занятие 6).

Выявление IgE и IgG4 проводится в отношении более чем 400 аллергенов, включающих пищевые аллергены; аллергены бактерий и грибов, шерсти и перхоти животных, перьев птиц; аллергены пыльцы трав и деревьев; аллергены клещей, домашней и библиотечной пыли, ядов насекомых; лекарственные и профессиональные аллергены.

В настоящее время разработаны тест-системы, позволяющие осуществлять множественную диагностику специфических IgE. Множественный аллергосорбентный тест с применением хемилюминесцентного анализа (MAST-CLA, или аллерготест МАСТ) позволяет одномоментно определить до 36 аллергенов, используя малый объем сыворотки (0,75 мл). Для проведения теста используется МAСT-аллергопанель, представляющая собой полый прозрачный пластмассовый корпус с параллельно расположенными внутри тончайшими целлюлозными нитями, на которых сорбированы аллергены (рис. 9.1).

Примечание: 1 - МАСТ-панель в сборе, 2 – крышка,

3 - целлюлозные нити с адсорбированным аллергеном, 4 - корпус

Рис. 9.1 Принцип хемилюминесцентного анализа при проведении МАСТ

Сущность аллерготеста МАСТ заключается в проведении реакции связывания аллергена со специфическим IgE с последующим мечением образовавшегося комплекса фотореагентом и определением его свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации специфического IgE в сыворотке пациента. МАСТ аллергопанель заполняется (обычным шприцом) сывороткой пациента, инкубируется при комнатной температуре 16–24 часа. Затем после промывания панели обычной дистиллированной водой с буфером, она заполняется конъюгатом (анти-IgG, меченые пероксидазой) и инкубируется в течение 4 часов. Далее после промывания панель заполняется фотореагентом и анализируется в люминометрах. Прибор регистрирует класс величин от 0 до 4 в соответствии с уровнем люминесценции от каждой индивидуальной нити панели. Эти классы соответствуют классам кожных проб. Уровни IgE, соответствующие классам аллергии МАСТ и показаниям люминометра, представлены в таблице 9.2

Таблица 9.2

Интерпретация результатов при проведении множественного аллергосорбентного теста

МАСТ класс	Считываемые величины, LU	Уровень аллерго- специфических IgE	КонцентрацияIgE, нг/мл
	>242	Очень высокий	>24.00
	143-242	Высокий	>12.00
	66-142	Средний	>6.00
	27-65	Низкий	>1.68
1/0	12-26	Оченьнизкий	>0.52
	0-11	Неопределяемый

Наряду с выявлением специфических IgE используются и другие лабораторные тесты для диагностики как антителозависимых реакций, так и реакции замедленного типа. Данные методы позволяют изучить особенности патогенеза аллергических реакций. К ним относятся:

- реакция дегрануляции тучных клеток или базофилов,

- реакция торможения миграции лейкоцитов крови (РТМЛ),

- реакция повреждения нейтрофилов (РПН),

- определение свободного связанного гистамина,

- определение ИЛ 4,5,6, TGFb,

- определение триптазы и химотриптазы (триптаза, особенно β-форма, может быть обнаружена в крови через 4 ч после анафилактической реакции и служит клиническим маркером анафилаксии),

- определение лейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4) с помощью клеточного теста высвобождения медиаторов,

- определение количества активированных базофилов, экспрессирующих на поверхности антиген CD63 (gp53) в ответ на стимуляцию аллергеном (цитометрический аллергенстимулирующий клеточный тест, ЦАСК-тест).

Определение этих показателей позволяет понять индивидуальные особенности течение аллергических реакций, что важно для лечения пациента.

Клеточный тест высвобождения медиаторов основан на определении сульфидолейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4), секретируемых базофилами под действием аллергена in vitro (рис. 9.2). Его также называют провокационным тестом in vitro. Благодаря синтезу сульфидолейкотриенов de novo этот тест обладает более высокой специфичностью по сравнению с классическим тестом высвобождения гистамина. Протокол исследования включает три этапа:

1) выделение популяции лимфоцитов из стабилизированной ЭДТА крови,

2) стимуляция лимфоцитарной суспензии специфическими аллергенами,

3) иммуноферментный анализ синтезированных базофилами лейкотриенов во время стимуляции.

РЕ– фикоэритрин
, FITC–флуоресцеинизотиоцианат,CAST (CellularAntigenStimulationTest) – клеточный тест высвобождения медиаторов, FLOW-CAST – цитометрическийантитген стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест)

Рисунок 9.2 Принцип тестов антигенной стимуляции базофилов

Тест считается положительным для пищевых, ингаляционных аллергенов, латекса, ядов насекомых при определении уровня лейкотриенов 200 пкг/мл; для лекарственных аллергенов, а также пищевых и химических добавок 40 пкг/мл.

Цитометрический вариант теста стимуляции базофилов – цитометрический антиген, стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест) позволяет определить количества активированных базофилов, экспрессирующих на поверхности антиген CD63. Этапы выделения лимфоцитов и стимуляции их антигенами для обоих вариантов (иммуноферментного и цитометрического) идентичны. Но вместо сульфидолейкотриенов на третьем этапе определяется количество активированных базофилов, экспрессирующих на поверхности антиген CD63 (gp53) в ответ на стимуляцию аллергеном. Тест высокочувствителен и специфичен при реакциях анафилактического типа, особенно при лекарственной гиперчувствительности.

При ЦАСК-тесте выделенные лейкоциты инкубируют со стимулирующим буфером и аллергеном. Затем добавляют анти-IgE моноклональные Ат с флюоресцентной меткой для идентификации базофилов, после чего добавляют моноклональные Ат к CD63 (см. рис. 9.2), и на поверхности базофилов определяют экспрессию CD63 АГ методом проточной цитометрии. Например, для пищевых и ингаляционных аллергенов тест считается положительным при экспрессии CD63 на поверхности 15% базофилов; для ядов насекомых – 10%; бета-лактамных антибиотиков и анальгетиков – 5% базофилов и индекс стимуляции 2. Рассчитывают индекс стимуляции, определяемый как отношение CD63⁺ базофилов в пробе с аллергеном (в %) к количеству этих клеток в пробе без аллергена (в %).

ЦАСК-тест специфичен для определения IgE-опосредованной аллергии к ингаляционным аллергенам (когда кожные пробы нельзя проводить из-за опасности развития спазмы бронхов и астматического статуса), пыльцевым, лекарствам, бета-лактамным антибиотикам, миорелаксантам, анальгетикам, аллергии к латексу, укусам перепончатокрылых насекомых, псевдоаллергических реакций к противовоспалительным нестероидным препаратам, индуцированным компонентами комплемента, плазмой, определение аутоантител к IgE. Результаты ЦАСК-теста хорошо коррелируют с результатами кожных проб.

Оба теста высокоспецифичны для диагностики пищевой аллергии и непереносимости, ингаляционной аллергии, когда кожные тесты не могут быть использованы (при аллергии на латекс, укусы перепончатокрылыми насекомыми, аллергии у детей, лекарственной аллергии и непереносимости, различных псевдоаллергических реакций).

Применение ЦАСК-теста и клеточного теста высвобождения медиаторов в диагностике пищевой аллергии и непереносимости, псевдоаллергических реакций может быть использовано для составления гипоаллергенной и элиминационной диеты.

Диагностика псевдоаллергических реакций. Псевдоаллергические реакции по клинической симптоматике могут быть сходны с истинными IgE-опосредованными реакциями, но отличаются по механизму развития. Их развитие не связано с выработкой Ат или участием сенсибилизированных лимфоцитов, в патогенезе этих реакций выделяют только две стадии – патохимическую и патофизиологическую. В связи с этим у таких пациентов в сыворотке крови обычно концентрация IgE находится в пределах нормы.

Однако при псевдоаллергических реакциях происходит неспецифическое высвобождение медиаторов: гистамина, лейкотриенов, простагландинов. Поэтому для диагностики псевдоаллергических реакций используются ЦАСК-тест для выявления активированных базофилов и клеточные тесты высвобождения медиаторов для установления концентрации LTC4, LTD4 и LTE.