Слияние плоских БЛМ

Общая картина процесса. Плоские БЛМ являются очень удобной и эффективной моделью, которая помогла решить множество задач биофизики мембран. Плоская БЛМ обычно формируется в ячейке, состоящей из двух камер, разделенных тонкой тефлоновой перегородкой, в которой имеется маленькое отверстие диаметром порядка 1 мм. Ячейку заполняют раствором электролита, в камеры вводят электроды и на перегородку в области отверстия наносят каплю раствора фосфолипидов в органическом растворителе, например в н-декане. Капля самопроизвольно растекается, при этом избыток липида и растворителя вытесняется на периферию отверстия, формируя так называемый мениск, а в центре отверстия возникает липидный бислой толщиной около 4 нм. Естественно было применить эту модель для изучения слияния мембран, создав вместо одного бислоя два расположенных соосно. Это было реализовано с помощью трехкамерной ячейки, изображенной на рис. 3.

Мембраны М₁, и М₂ формируются на отверстиях в перегородках, стержни 4 и 5 позволяют повышать давление в отсеках I и III и тем самым выдавливать бислои навстречу друг другу. Во всех отсеках находятся электроды, подключенные к измерительной аппаратуре, которая позволяет регистрировать омический и емкостный токи, а также измерять плотность поверхностного заряда любого монослоя до и после слияния. Площадь бислоев определяется визуально с помощью микроскопа. Эта методика требует от исследователя незаурядного мастерства, но зато позволяет наблюдать и изучать всю последовательность стадий процесса слияния.

После приведения в контакт двух бислоев удается выявить одни и те же характерные стадии процесса слияния (рис. 4):

● состояние 1 – выдавливание мембран навстречу друг другу из исходного положения с помощью перепада гидростатического давления приводит к постепенному уменьшению толщины водной прослойки между ними;

● состояние 2 – установления равновесного плоскопараллельного контакта при котором гидростатическое давление и молекулярное притяжение, сближающие бислои, уравниваются с действующими в противоположном направлении силами гидратационного и электрического отталкивания;

● состояние 3 – два бислоя, находившиеся в тесном контакте, превращаются в один бислой, обеспечивающий непрерывность внешних монослоев мембран в пределах всей системы. Можно сказать, что здесь произошло полуслияние: мембраны объединились, но водные объемы камер I и III по-прежнему разъединены. Термин "полуслияние" отражает и то обстоятельство, что слились только внешние монослои мембран. Чтобы убедиться в этом, достаточно пометить липиды во внешнем монослое одной мембраны, включив в нее например, какое-то количество заряженных липидов, тогда как другая мембрана таковых не содержит. Измерения поверхностного потенциала показали, что после завершения полуслияния заряженные липиды обнаруживаются во внешнем монослое второй мембраны. Переход из стадии 2 в 3 является самопроизвольным. Состояние 3 является довольно устойчивым;

● состояние 4 – прикладывая к контактному бислою электрическое поле можно разрушить контактный бислой и тем самым завершить процесс слияния. В результате возрастает вероятность появления в нем поры, развитие которой приводит к разрушению бислоя. Эта стадия фактически завершает процесс слияния, так как теперь объединены и мембраны, и водные объемы отсеков I и III.

Механизм полуслияния. Можно представить несколько механизмов превращений двух соприкасающихся бислоев в один.

Например, пусть липидные молекулы одного бислоя расступаются, и между ними внедряются липиды из второго бислоя (рис. 5, а). Энергетические расчеты, однако, показывают, что для реализации этого механизма интеркаляции необходимо приложить к исходным бислоям фантастическое давление, которое эквивалентно создаваемому водяным столбом в 100 км высотой. Это связано с тем, что требуются громадные усилия, чтобы перенести полярные головки фосфолипидов через гидрофобный слой мембраны. Экспериментально было установлено следующим образом: исходный бислой формировали из разных фосфолипидов – один из нейтральных, а другой из заряженных. Затем их слили, получили контактный бислой и измерили плотность поверхностного заряда на его монослоях. Предсказание совершенно очевидно: если работает механизм встраивания, то оба монослоя контактной мембраны должны стать равно заряженными с половинной от исходной плотностью заряда (рис. 5, а). Результат оказался совершенно другим: один монослой остался нейтральным, а другой сохранил прежний заряд. Отсюда следует очевидный вывод – контактный бислой формируется из удаленных монослоев исходных мембран, а близлежащие монослои отступают из области контакта (рис. 5, б). Визуальные наблюдения показывают, что полуслияние начинается из одной точки. Это подтверждается также измерениями емкости системы в реальном времени.

Опыты показали, что времена ожидания полуслияния имеют порядок от секунд до минут и в существенной степени зависят от липидного состава мембран. Рост емкости во времени, очевидно, отражает динамику роста зародыша контактного бислоя.

Модель сталков. Прежде всего заметим, что полуслияние энергетически выгодно, так как переход из состояния 2 в 3 (рис. 4) уменьшает суммарную поверхность системы: вместо двух бислоев мы получаем один. Однако состояния 2 и 3 отделены активационным барьером, который определяет время ожидания монослойного слияния. Преодолеть этот барьер помогают тепловые флуктуации. Высота барьера во многом определяется свойствами промежуточных состояний, через которые осуществляется переход 2 → 3. Их выбор диктуется тем, какие деформации претерпевает бислой в ходе тепловых флуктуаций.

Напомним, что липидный бислой – жидкий кристалл. Латеральная (вдоль бислоя) подвижность лилидных молекул велика, в этом направлении мембрана течет как обычная жидкость. В перпендикулярном к поверхности направлении липидный бислой гораздо ближе к твердому телу, он с трудом поддается сжатию. Кроме того, липидный бислой обладает жесткостью на изгиб, чтобы его согнуть, необходимо приложить изгибающий момент сил. Именно эти виды деформаций – латеральное смещение молекул и их изгиб, которые активируются тепловой энергией среды, – существенны для возникновения зародыша полуслияния и его роста.

Механизм полуслияния, проиллюстрированный на рис. 6, изображает последовательность состояний на пути от двух бислоев (1) к одному контактному бислою (4). Предполагается, что под действием тепловых флуктуаций происходят локальные деформации изгиба и латерального сдвига, в результате которых образуются вспучивания, экспонирующие в раствор гидрофобные «хвосты» липидиных молекул. Притяжение таких гидрофобных пятачков на соседних мембранах приводит к формированию между ними перемычки (3), которую назвали сталком (от англ. stalk – стебелек).

Сталк обладает высокой энергией, так как формирующий его липидный бислой сильно изогнут. Расширение сталка, сопровождающееся слиянием удаленных монослоев, приводит к образованию контактного бислоя. Однако, чтобы сталк спонтанно расширялся, его энергия должна убывать по мере расширения. Расчет энергии сталка показал, что она зависит от природы липидов и их склонности к изгибным деформациям.

Подводя итоги исследований слияния в модельных системах, следует отметить следующие принципиальные результаты. Прежде всего, удалось показать, что липидные бислои могут самопроизвольно сливаться, если они приведены в тесный контакт. Кроме того, установлено, что процесс перезамыкания мембран протекает через две последовательные стадии:

o В ходе первой возникает перемычка (сталк) между близлежащими монослоями, которая расширяется, формируя контактный бислой. Этому процессу способствует отрицательная спонтанная кривизна близлежащих монослоев.

o Вторая стадия – переход от полуслияния к полному слиянию требует разрушения контактного бислоя, чему способствует положительная спонтанная кривизна удаленных монослоев или повышенное натяжение.