Определение содержания креатинина в биологических жидкостях

Задание 1. Определить содержание креатинина в сыворотке крови.

Принцип. Креатинин при взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде образует соединение оранжево-красного цвета, интенсивность которого определяют фотометрически.

Ход работы. Опытная проба - вносят 0,5 мл сыворотки крови, 1 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты; калибровочная проба (эталонная) - вносят 0,5 мл калибровочного раствора (концентрация креатинина - 177 мкмоль/л), 1 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое обеих пробирок перемешивают, оставляют стоять 5 мин, затем центрифугируют при 2500-3000 об/мин на протяжении 5 мин. Надосадочную жидкость сливают. В две центрифужные пробирки вносят по 1 мл надосадочной жидкости из каждой пробы, прибавляют по 0,5 мл пикриновой кислоты (0,04 моль/л) и 0,5 мл NaOH (0,75 моль/л). Перемешивают и точно через 20 мин фотометрируют в 1 см кювете при 505 нм против раствора сравнения. Раствор сравнения: в центрифужную пробирку вносят 1,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты; перемешивают. Из этого раствора берут 1 мл и переносят в отдельную пробирку, прибавляют 0,5 мл пикриновой кислоты и 0,5 мл натрия гидроксида.

Концентрацию креатинина (Х) в мкмоль/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле: Х=(Сэт.×Еоп.)/Еэт., где Сэт. - концентрация креатинина в эталонной пробе (177 мкмоль/л); Еоп. - оптическая плотность опытной пробы; Еэт. - оптическая плотность эталонной пробы. В норме содержание креатинина в сыворотке крови (натощак) составляет: для мужчин - 61-115 мкмоль/л, женщин - 53-97 мкмоль/л.

Внимание! При работе необходимо строго придерживаться правил работы с отравляющими веществами в химических лабораториях, так как пикриновая кислота - яд, а трихлоруксусная кислота и NaOH - едкие вещества!

Задание 2. Определить содержание креатинина в моче.

Принцип. Тот же.

Ход работы. Определение проводят в центрифужных пробирках, которые заполняют в соответствии со схемой:

	Опытная проба	Раствор сравнения
Моча разбавленная 1:100 (мл)	0,5	-
Вода дистиллированная (мл)	0,25	0,75
Трихлоруксусная кислота (мл)	0,25	0,25
Пикриновая кислота (мл)	0,5	0,5
NaOH (мл)	0,5	0,5

Перемешивают содержимое пробирок и точно через 20 мин измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при 505 нм. Эталонный (калибровочный) раствор готовят как и в случае определения креатинина в сыворотке крови. Количество креатинина (У) в ммоль/сут в моче рассчитывают по формуле:

У=(Сэт.×Еоп.×Д×50)/(Еэт.×1000), где Сэт. - концентрация креатинина в эталонной пробе (177 мкмоль/л); Еоп. - оптическая плотность опытной пробы; Еэт. - оптическая плотность эталонной пробы; Д - суточный диурез (1,5 л); 1000 - перевод мкмоль в ммоль; 50 - разведение мочи. В норме содержание креатинина в моче составляет: для мужчин - 8,8-17,7 ммоль/сут (1,0-2,0 г); женщин - 7,1-15,9 ммоль/сут (0,8-1,8 г).

Клинико-диагностическое значение. Концентрация креатинина в сыворотке крови здоровых людей относительно постоянная в результате строгой зависимости между его образованием и выделением. Креатинин относится к беспороговым веществам, он фильтруется только клубочками, но не реабсорбируется. Секреция креатинина канальцами возможна только при высокой концентрации его в крови. Определение креатинина для оценки клубочковой фильтрации обусловлено тем, что его концентрация в плазме обратно пропорциональна клиренсу при постоянных условиях выделения и концентрирования. Критической верхней границей установлена концентрация креатинина на уровне 115 мкмоль/л. Уровень креатинина в сыворотке повышается при ретенционных азотемиях. По нарастанию его концентрации в крови определяют степень хронической почечной недостаточности. Количество выделенного с мочой креатинина прямо зависит от содержания фосфокреатинина в мышцах. Количество креатинина в моче будет изменяться также и в зависимости от содержания креатинина в пище (его много в мясных продуктах). Повышенной экскрецией креатинина (гиперкреатинурия) сопровождаются лихорадочные состояния, острые инфекционные заболевания, сахарный и несахарный диабет. Креатинурия свидетельствует о патологии поперечно-полосатых мышц (мышечная дистрофия, атрофия, миастения). Гипокреатинурия наблюдается при заболеваниях почек, а именно - при хроническом нефрите, мышечной атрофии, после перенесенных инфекций, в преклонном возрасте и при алиментарной дистрофии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 250-261.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 303-314.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.–С.419-426, 429-430.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 451-456, 459-468.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 494-504, 515-517.

6. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 323-331.

7. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.146-167.