Дослід 2. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину

Матеріали та реактиви: колби плоскодонні, конічні, бюретки для титрування, скляні палички, піпетки, пробірки, водяна баня, розчин казеїну, ферментний препарат, 0,02 М NaOH, 0,2 М розчином натрій гідроксиду, 4 мл фосфатного буфера з рН 7,6, формольної суміші (40% розчин формальдегіду з рН 8,3), 6%-й лужний розчин казеїну готують аналогічно як у попередньому досліді, індикатор – фенолфталеїн.

Принцип методу ґрунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні зв’язки, що призводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних груп. Після блокування аміногруп формаліном карбоксильні групи підвищують кислотність середовища, приріст якого визначають шляхом титрування лугом за методом Зеренсена в присутності індикатора фенолфталеїну.

Хід роботи. У дві пробірки додають по 5 мл 6% розчину казеїну і по 2 мл фосфатного буфера з рН 7,6. В одну з пробірок додають 0,5 г панкреатину, старанно перемішують і ставлять в термостат за температури 37^оС разом з контрольною пробіркою.

Через 30 хв. пробірки виймають з бані, охолоджують. Їх вміст переливають у колбочки для титрування. Додають у кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і підлужують з піпетки 0,2 М розчином натрію гідроксиду до утворення слабко-рожевого забарвлення (рН 8,3). За такого рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формольної суміші (рН 8,3). Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають значення рН розчину до кислих значень. Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують з бюретки 0,02 М розчином NaOH до утворення слабко-рожевого забарвлення (рН 8,3) і додають ще декілька крапель 0,02 М розчину NaOH до утворення яскраво-червоного кольору (рН 9.1).

Розрахунок. Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях. Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0,02 М розчину натрій гідроксиду, використаного на титрування дослідної проби.