Методы изучения мазков

Витальные наблюдения. Берут каплю крови или выделений животного, помещают на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют под микроскопом при объективах 20^х или 40^х. Если исследуется кровь, то в нее следует добавить 1-2% раствор лимоно-кислого натрия для предотвращения ее свертываемости. Иногда под покровное стекло по уголкам подкладывают кусочки другого покровного стекла или кусочки из пластилина, чтобы увеличить пространство под стеклом. Чтобы такой препарат не высох преждевременно, по периметру стекла наносят слой вазелина или кузбасслака.

Можно использовать предметное стекло с лункой. В таком случае исследуемый субстрат помещают в форме маленькой капли на внутреннюю сторону покровного стекла, которое помещается каплей вниз над центром лунки, а по периметру также наносят вазелин.

Такие препараты исследуют либо в "падающем" свете, либо на "темном" поле. В последнем случае обычный конденсор заменяют параболическим. В таких случаях на темном поле живые и очень подвижные трипанозомы хорошо видны.

Чаще пользуются специальными методами окраски паразитов.

Прижизненное окрашивание. В качестве красителя используют нейтральрот. Исследуемый субстрат разводят физиологическим раствором и прибавляют в него нейтральрот в разведении 1:100 000. Живые трипаносомы хорошо прокрашиваются - плазма (как щелочная среда) в желто-красный цвет, ядра - в вишнево-красный, капли жира - в красный.

Можно пользоваться метиленовой синью в разведении 1:500 или 1:10 000. Краска должна быть химически чистой. Как и в предыдущем случае, краску вносят в приготовленный раствор изучаемой среды. Живые паразиты прокрашиваются, показывая плазму голубой, ядра - буро-красными, если есть бактерии, то они становятся ярко-синими.

При использовании краски бриллиант-крезил-блау в разведении 1:1000 прокрашиваются разные ткани и части клеток в разные цвета. При pH, сдвинутой в щелочную сторону, преобладают красные оттенки, при кислой среде - от фиолетового до синего, если pH нейтральна - красный цвет.

Чаще берут мазки из крови, слизей и других выделений.

Для получения мазков хорошего качества необходимо предметные стекла тщательно промыть и обезжирить их поверхность. Последнее достигается обработкой стекол этиловым спиртом. Мазок изготавливается следующим образом: каплю исследуемой среды (кровь или другие выделения животного) помещают на поверхность предметного стекла, которое исследователь держит горизонтально в левой руке. Правой рукой берут другое стекло, предметное или покровное, погружают его под углом в каплю и быстрым движением проводят им до другого края горизонтального стекла так, чтобы исследуемый материал был равномерно распределен по его поверхности. Изготовленный таким способом мазок должен быть зафиксирован. Лучшим фиксатором в таких случаях является 100% метиловый спирт. Свежеприготовленный мазок может быть слегка подсушен.

Правильно приготовленный и зафиксированный мазок (после содержания в чашке Петри в течение 15-20 минут под слоем метилового спирта) промывают проточной водой и подсушивают. В таком виде он может храниться достаточно долго и даже пересылаться в другие лаборатории для изучения. Каждый мазок должен быть обеспечен этикеткой, квадратным кусочком бумаги, приклеенным на одном крае стекла. На нем тушью или простым карандашом должно быть написано: вид животного и его индивидуальный номер (его маркировочная метка), порядковый номер пробы по журналу регистрации, хозяйство, дата взятия пробы и фамилия того, кто взял эту пробу и сделал мазок.

При отсутствии метилового спирта мазки фиксируют смесью 100% этиловый спирт + серный эфир в соотношении 1:1. 100% этиловый спирт получают путем обезвоживания обычного 96% спирта. Обезвоживание производят с помощью прокаленного медного купороса. Прокаливание купороса производят на электроплите в фарфоровой чашке до получения белого порошка. Последний помещают в стеклянную посуду с притертой пробкой и заливают в соотношении 1:20 используемым в дальнейшем спиртом.

Мазки должны быть окрашены специальными красителями. Лучшим красителем паразитических простейших считается краска Гимза-Романовского. Обычно она используется в готовом виде, но может быть приготовлена и самим исследователем по следующему рецепту:

азур II + эозин (или эозин В.А.) - 3 г,

азур II - 0,8 г,

глицерин (нейтральный и химически чистый) - 12 мл,

метиловый спирт (нейтральный и химически чистый) - 375 мл.

Смесь растворяют нагреванием на водяной бане при 60°С. Полученную краску фильтруют через 24 часа. Краска должна созреть при хранении в термостате в течение месяца.

Замечания к красителям: азур I - окисленная метиленовая синь (по Гимза), азур II - смесь равных частей азур I и неокисленной метиленовой сини. Окисление метиленовой сини производят путем длительного содержания ее в открытой посуде на воздухе.

Рабочий раствор краски Романовского-Гимза приготавливают путем растворения 1 капли маточного красителя в 1 мл дистиллированной воды. Последняя должна быть нейтральной, иначе краситель образует черный осадок, хлопья.

Окрашивание производят в чашках Петри. Мазки кладут лицевой стороной вниз, поместив под них стеклянные палочки или, что хуже, спички (без серных головок!). Под стекла заливают краситель. Длительность окраски - от 15 минут до одного часа в зависимости от возраста мазков. Чем мазки моложе, тем краска идет быстрее, чем они старше, тем окраска идет хуже. Предел хранения фиксированных, но не окрашенных мазков не более 3-4 недель. Окрашивание идет лучше в термостате при 37°С. Окрашенные препараты промывают проточной водой, сушат и хранят достаточно долго без доступа света, т.к. на свету они обесцвечиваются.

На правильно окрашенных мазках видна следующая картина. Эритроциты красятся в равномерный красный или розовый цвет, паразиты становятся разноцветными. Их плазма голубая, ядра - ярко-красные. Так же окрашиваются и лейкоциты.

Если мазок перекрашен, его можно дифференцировать, извлечь из него лишнюю краску. Для этого мазок помещают в 80% этиловый спирт, подкисленный соляной кислотой: 2 капли кислоты на 100 мл спирта. Можно дифференцировать 4% таннином.

Ускоренный вариант окраски. На нефиксированные мазки, помещенные в чашку Петри, наносят на 1 минуту по 15-20 капель смеси из равных частей маточного раствора Гимза-Романовского и ацетона. Сюда же добавляют 8-10 мл дистиллированной воды, покачивая, смешивают, через 5-10 минут мазки извлекают, промывают и сушат.

Помимо окрашивания по Гимза-Романовскому, можно красить мазки и другими методами. Например, по Мансону в качестве красителя используют азур-метил-виолет.

Окраска по Божевольному. Готовят мазок, фиксируют его подсушиванием на пламени спиртовки. Для этого его держат обратной стороной к пламени так, чтобы не перегреть стекло. Осторожно проводят несколько раз над ним. Фиксированный таким способом мазок красят в 1%-водном растворе генцианвиолета. После окраски поверхность мазка смывают сильной струей воды, сушат и микроскопируют, как обычно.

Окраска по Арнольдову. Готовят мазок, как обычно. Фиксируют метиловым спиртом. Красят смесью из равных частей 1% спиртового раствора азура и эозина (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Мазки помещают в чашку Петри под слой краски на 4-7 часов. После покраски мазки смывают струей воды, сушат и микроскопируют.

Окраска по Нохту. Сухие краски азура и эозина порознь растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:1000. Каждый раствор хранят отдельно в склянках с притертыми пробками. Для приготовления рабочего раствора берут одну часть раствора эозина и 2 части раствора азура и совмещают в 3-х частях воды. Полученный рабочий раствор используют для окраски мазков, изготовленных и фиксированных обычным способом. Время окрашивания - 1 час.

Окраска по Лейшману. Сухую краску азура растворяют из расчета: 0,15 г краски на 100 мл чистого метилового спирта. Можно красить не фиксированные мазки. Время окраски 2 минуты.

Метод Щуренковой-Можайской.Готовят следующий раствор А:

1. 1 г метиленовой сини растворяют в 65 г кипяченой воды.

2. 1,5 г марганцово-кислого калия растворяют в 75 мл воды.

3. Оба раствора смешивают, приливая первый во второй, выдерживают на водяной бане 40 минут, фильтруют и после остужения используют.

Затем готовят два раствора.

Раствор I: 1 часть раствора А, 2 части подкисленной воды (к 20 мл воды добавить 15 капель соляной кислоты).

Раствор II: 0,5 г эозина растворяют в 500 мл кипяченой воды.

Окраска: фиксированные мазки погружают в раствор I на 15-20 секунд, прополаскивают и помещают в раствор II на 25-30 секунд, отмывают, сушат и изучают.

Окраска по Мошковскому. Приготовление основных растворов.

Раствор I. Берут 1 г метиленовой сини, 2,5 г буры, 100 мл воды, растворяют кипячением, охлаждают, фильтруют и разводят в 8-10 раз.

Раствор II. Берут 5-10% раствор таннина, фильтруют, добавляют пару кристалликов тимола или камфоры для стерилизации.

Фиксированные обычным способом мазки погружают в раствор I на 5-10 секунд, промывают в воде, помещают в раствор II на 2-5 секунд, промывают, сушат и изучают.

В тех случаях, когда имеют дело с паразитоносителями, возбудителя на мазках обнаружить очень трудно. В таких случаях можно использовать метод толстой капли. Толстую каплю исследуемого материала (кровь или выделения из половых путей) наносят на предметное стекло и прокрашивают следующим красителем:

4 г 1% раствора метиленовой сини (готовится заранее),

1 г 1% раствора фуксина на 50% спирте,

4 г 1% раствора уксусной кислоты,

40 мл дистиллированной воды.

Окраска. Нефиксированный мазок-каплю помещают в чашку Петри и заливают красителем на 15 минут, затем, наклонив чашку Петри и, поливая водой на мазок, смывают краску. Затем мазок сушат и микроскопируют. В таком препарате материал находится в концентрированном состоянии, эритроциты растворяются и не мешают изучать паразитов.