Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, получения диагностических и вакцинных препаратов, в научно-исследовательской работе.

Поскольку вирусы являются абсолютными паразитами, то их культивируют или на уровне организма, или на уровне живых клеток, выращиваемых вне организма в искусственных условиях. В качестве биологических моделей для культивирования используются лабораторные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные (белые мыши, хлопковые крысы, кролики, хомяки, обезьяны) в начальный период развития вирусологии были единственной экспериментальной биологической моделью, которую использовали для размножения и изучения свойств вирусов. На основании развития типичных признаков заболевания и патоморфо-логических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов. В настоящее время использования этой модели для диагностики ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.

Куриные эмбрионы предложены в качестве экспериментальной модели для культивирования вирусов в середине 30-х годов Ф.Бернетом. К достоинствам модели относится возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша (демонстрация табл. №).

Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации - склеиванию эритроцитов. Явление гемагглютинации впервые было обнаружено в 1941г. при культивировании в куриных эмбрионах вирусов гриппа. Позднее было установлено, что гемагглютинирующими свойствами обладают многие вирусы. На основе этого феномена была разработана техника реакции гемагглютинации (РГА) вне организма, которая широко применяется для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Куриные эмбрионы не являются универсальной биомоделью для вирусов. Почти неограниченные возможности появились у вирусологов после открытия метода выращивания культур клеток.

Метод культур клеток - выращивание различных клеток и тканей вне организма на искусственных питательных средах – разработан в 50-х годах Дж. Эндерсом. Подавляющее большинство вирусов способно размножаться на культурах клеток. Для приготовления культур клеток используют самые разнообразные ткани человека, животных и птиц. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих по сравнению с нормальной тканью взрослого организма более активной способностью к росту и размножению. В зависимости от техники изготовления и культивирования различают 3 основных типа культур клеток и тканей:

1) однослойные культуры клеток;

2) культуры суспензированных клеток;

3) органные культуры.

Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры, растущие на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток (рис. 3.4,а).

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций в свою очередь подразделяют на первичные, или первичнотрипсинизированные (способные размножаться однократно), перевиваемые (способные перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно длительного срока) и полуперевиваемые (способные размножаться в течение 40-50 пассажей).

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они могут быть использованы для накопления большого количества вирусов.

Некоторые вирусы лучше размножаются в органных культурах, которые представляют собой кусочки органов животного или человека, выращиваемых вне организма и сохраняющих свойственную данному органу структуру.

В зависимости от свойств вируса подбирают наиболее чувствительную к данному вирусу культуру клеток, на которой возможна его репродукция. О размножении вирусов в культуре клеток судят по следующим признакам:

Ø цитопатическому эффекту (ЦПЭ, ЦПД);

Ø образованию в клетках включений;

Ø образованию бляшек;

Ø феномену гемадсорбции;

Ø «цветной» реакции (цветной пробе).

ЦПЭ - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до их гибели (рис. 3.4,б). Характер ЦПЭ, вызванный разными вирусами, неодинаков, например размножение вируса полиомиелита сопровождается дегенерацией клеток, а вирусы парагриппа репродуцируются в клеточных культурах, вызывая слияние клеток с образованием многоядерных гигантских клеток-синцития.

Включения представляют собой скопления вирусных частиц (тельца Пашена при натуральной оспе), вирусных белков или клеточного материала, которые можно обна-ружить в ядре или цитоплазме клеток при специальных методах окраски (включения Бабеша-Негри при бешенстве, включения Гварниери при натуральной оспе).

Бляшки или «негативные колонии» вирусов - участки разрушенных вирусами клеток – можно обнаружить при культивировании вирусов на однослойных клеточных культурах, покрытых тонким слоем агара (демонстрация табл. №)бентонитового покрытия (демонстрация флакончиков с бляшками вируса полиомиелита).

Бляшки, образуемые разными вирусами, отличаются по величине, форме, времени появления, поэтому феномен бляшкообразования используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции - способность клеточных культур, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Механизмы реакций гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Многие вирусы обладают гемадсорбирующими свойствами.

«Цветная» реакция (проба) основана на разнице в цвете питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, происходит накопление продуктов метаболизма, что приводит к изменению цвета питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается нормальный метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет (демонстрация ЦП).