Молекулярные основы наследственности

1. Роль нуклеиновых кислот как носителей генетической информации.

2. Структура нуклеиновых кислот.

3. Репликация ДНК. Этапы. Ферменты.

4. Транскрипция ДНК. Этапы. Сплайсинг про- и РНК у эукариот.

5. Генетический код.

6. Трансляция и РНК. Рибосомы, и РНК, тРНК.

Период между открытием единиц наследственности и выявлением их материальной сущности был довольно длительным. Ни Г.Мендель, сумевший на частном мере наследования единичных признаков у гороха единый для всего живого принцип переноса единиц на­следственности (генов) от родителей к потомству, ни Г.де Фриз, К. Корренс и Э. Чермак, переоткрывшие законы Менделя, ни цитологи В.Ру, Т.Бовери, В.Сэттон, ни даже создатели хромосомной теории Т.Морган и его школа, получившие строгие доказательства локализации генов в виде дискретных единиц в хромо­сомах, ничего не знали о химической природе генов. Вместе с тем основное вещество наследственности — дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — было открыто швейцарским врачом и химиком Р.Мишером еще в 1868 г., т.е. всего через три года после опублико­вания работ Менделя, знаменующего собой рожде­ние генетики как науки. Понадобилось около 80 лет, чтобы установить роль ДНК как главного носителя наследственной информации.

Роль нуклеиновых кислот как носителей генетической информации. Большую роль в выяснении химической природы генов сыграли опыты Ф.Гриффитса (1928), обнаружившего у пневмококков (Streptococcus pneumonia) явление транс­формации. Известно несколько типов пневмококков, различающихся по виду и размеру колоний, наличию или отсутствию плотной полисахаридной капсулы, защищаю­щей их от фагоцитоза. При росте на питательной среде пневмококки, окруженные капсулой, образуют крупные гладкие колонии. Такие пневмококки, отнесенные к типу S (от англ. smooth — гладкий), являются воз­будителем пневмонии у человека и некоторых животных, в том числе мышей. Примерно одна из 10⁷ клеток пневмо­кокков может спонтанно превратиться (мутировать) в форму, лишенную полисахаридной капсулы. Бескапсульные пневмококки непатогенны, поскольку быстро уничтожаются путем фагоцитоза в организме зараженного животного или человека. На поверхности питательной среды такие бакте­рии, отнесенные к типу R (от англ. rough — шерохова­тый), образуют мелкие шероховатые колонии, которые легко отличить от гладких колоний, образуемых пневмо­кокками типа S. Пневмококки, кроме того, различаются по типу поверхностных антигенов, определяемому особенностями капсульного липополисахарида (например, тип IIIS, IIR и др.), что служит еще одним важным призна­ком, наследующимся в потомстве. Введение мышам уби­тых нагреванием пневмококков типа IIIS либо живых пневмококков типа IIR не вызывало гибели животных. Напротив, введение живых бактерий типа IIIS, как и предполагалось, привело к развитию тяжелой пневмонии и гибели большинства зараженных мышей. Неожиданными оказались результаты опытов, в которых мышам вводили смесь убитых бактерий типа IIIS и невирулентных пневмококков типа IIR. В этом случае многие животные также погибли от пневмонии, а из организма погибших мышей были высеяны живые пневмококки типа IIIS. Такое превращение некапсульных форм бактерий в вирулентные капсульные не зависело от организма хозяина, поскольку наблюдалось и в опытах in vitro, когда в пробирку, содер­жащую живые R-клетки, добавляли убитые клетки типа IIIS либо экстракты из них. В обоих случаях при высеве бактерий из пробирок на чашки Петри с питательной средой формировались не только шероховатые колонии, образованные бескапсульными бактериями, но обнару­живались и гладкие колонии, состоящие из клеток капсульных бактерий. Частота появления последних значи­тельно превышала частоту спонтанного мутирования бактерий из IIR-типа в IIIS-тип.

Эксперименты Гриффитса выявили существование некоего «трансформирующего начала», превращающего клетки пневмококков типа IIR в клетки типа IIIS. Однако сами по себе эти эксперименты не выявили химической природы вещества, обеспечивающего стойкое, наследуе­мое в потомстве превращение бактерий одного типа в другой. Это было сделано лишь спустя 16 лет, когда О.Эвери, К.Мак-Леод и М.Мак-Карти (1944) показали, что если ДНК, выделенную из убитых нагреванием пневмококков типа IIIS, смешать с живыми бактериями типа IIR, то последние приобретают способность формировать на агаре гладкие крупные колонии, состоящие из бактерий типа IIIS.

Следует иметь в виду, что в 20-40-годах XX века господствовало представление, согласно которому основ­ным веществом наследственности является белок. Поэто­му для доказательства того, что ДНК действительно являлась трансформирующим началом в опытах Гриф­фитса, препараты ДНК из пневмококков типа IIIS делили на порции, каждую из которых обрабатывали дезоксирибонуклеазой (ДНК-азой), рибонуклеазой или протеазой — ферментами, разрушающими соответственно ДНК, РНК или белки, а затем применяли для трансформации клеток типа IIR в тип IIIS. Оказалось, что только обработ­ка ДНК-азой полностью снимала трансформирующую активность препаратов ДНК. С другой стороны, по мере очистки ДНК от примесей белка частота трансформации увеличилась. Эта очистка была доведена до такой степени, что в препарате ДНК, полностью сохранившем трансфор­мирующую активность, белка было в 10000 раз меньше, чем ДНК. Обе группы фактов явились доказательством того, что генетическая информация, кодирующая капсульный полисахарид и его антигенную специфичность у пнев­мококков, находится в ДНК. Дальнейшее развитие этот важнейший вывод получил в экспериментах А.Херши и М. Чейз (1952). В качестве объекта генетических иссле­дований был использован один из вирусов бактерий — бактериофаг Т2, состоящий лишь из белковой оболочки, или чехла — капсида, и упакованной в него молекулы ДНК.

Структура нуклеиновых кислот. Доказательства генетической роли ДНК не отвечали, однако, на не менее важный вопрос: каким образом ДНК осуществляет две свои главные функции? Первая из них, аутокаталитическая, обусловливает способность ДНК к редупликации, или самоудвоению. Другая, гетерокаталитическая, определяет способность ДНК кодировать гене­тическую информацию, необходимую для того, чтобы образующееся потомство сохранило видовые признаки родителей. Прежде чем получить ответ на этот вопрос, рассмотрим, что было известно о структуре ДНК до 1953 г., когда Дж.Уотсон и Ф.Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, положившую начало изучению основ генетики на молекулярном уровне.

Нуклеиновые кислоты представляют собой макромолекулы, образованные повторяющимися структурами — нуклеотидами. Каждый нуклеотид состоит из трех компо­нентов: циклического азотсодержащего соединения, называемого основанием, сахара пентозы, включающего пять атомов углерода, и фосфорной кислоты. Известны пять главных азотистых оснований. Одно из них, урацил (2,6-оксипиримидин), обнаруживается только в РНК. Другое, тимин (2,6-окси-5-метилпиримидин), находится, как правило, только в ДНК. Остальные три основания: цитозин (6-амино-2-оксипиримидин), аденин (6-аминопурин) и гуанин (2-амино-6-оксипурин) – при­сутствуют как в ДНК, так и в РНК. Двуциклические основания — аденин и гуанин — относятся к пуринам, моноциклические основания — цитозин, тимин и урацил — к пиримидинам. Наряду с этими главными азотистыми основаниями в ДНК некоторых организмов обнаружены минорные редко встречающиеся основания: 5-метилцитозин, 5-оксиметилцитозин и др.

Сахар пентоза, входящий в состав РНК, является рибозой, а входящий в состав ДНК - 2-дезоксирибозой. Молекула РНК состоит из одной цепи, в которой последовательно чередуются четыре возможных нуклеотида. Существенное значение для понимания строения ДНК имели установленные Э.Чаргаффом закономерности, в соответствии с которыми в любой молекуле ДНК: 1) сумма пуринов равна сумме пиримидинов, т.е. А+Г=Т+У; 2) содержание А=Т, а содержание Г=Ц; 3) Г+Т=А+Ц.

Большую роль в расшифровке строения ДНК сыграло рентгеноструктурное исследование, проведённое (1953) М.Уолкинсом и Р.Франклин. Оно показало, что ДНК – упорядоченная структура, состоящая из повторяющихся элементов, расположенных вдоль оси молекулы на расстоянии 0,34 мм друг от друга.

Существенный элемент модели двойной спирали – принцип комплементарности, заключающийся в том, что спаривание оснований осуществляется строго специфично.

Комплементарность нуклеотидного состава противоположных цепей молекул ДНК обеспечивает её способность хранить и передавать генетическую информацию, она же лежит в основе аутокаталитической функции ДНК, т.е. репликации.

Репликация ДНК. Для того чтобы объяснить, каким образом может само­копироваться, или редуплицироваться, такая стабильная и замкнутая на себя структура, как двойная спираль ДНК, Уотсон и Крик предположили, что ее цепи способны к ра­скручиванию и последующему частичному разделению вследствие разрыва водородных связей в каждой компле­ментарной паре оснований. Образовавшиеся одноцепочечные участки родительской молекулы могут служить матрицей, к которой на основе комплементарности основа­ний присоединяются соответствующие нуклеотиды. Эти нуклеотиды скрепляются между собой фосфодиэфирными связями с образованием новой цепи, комплементарной родительской. Так как этот процесс происходит на каж­дой разделившейся цепи исходной молекулы, то в резуль­тате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшихся молекул одна цепь является ста­рой (родительской), а другая — вновь синтезированной (дочерней). Этот механизм обеспечивает возможность такого распределения ДНК между делящимися клетками, при котором каждая дочерняя клетка получает гибридную двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из родительской и вновь синтезированной цепей. Первые данные в пользу гипотезы полуконсерватив­ного механизма синтеза ДНК были получены Дж.Тэйлором с соавторами (1957) цитологическим методом при изучении репликации хромосом конских бобов (Vicia faba). Экспериментально эта гипотеза была доказана с помощью физико-химических методов М.Мезельсоном и Ф.Сталем (1958). Сущность их опыта состояла в следующем. Бактерии (Е. coli) на протяжении многих генераций вы­ращивали в среде, содержащей в качестве источника азота только его тяжелый изотоп ¹⁵N. Эта метка включалась в азотсодержащие пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, вследствие чего ДНК в клетках, выращенных в сре­де с ^|5N, имела большую молекулярную массу на единицу объема (т.е. большую плотность), чем ДНК в клетках, выращенных в обычных условиях, в присутствии легкого изотопа ¹⁴N. Поэтому если клетки после длительного выращивания на среде с ¹⁵N отмывали и переносили на время, равное одной, двум и т.д. генерациям, в среду с ¹⁴N вме­сто ¹⁵N, то это должно было привести к появлению моле­кул ДНК с меньшей плотностью.

По прошествии одной генерации после переноса из среды с ¹⁵N в среду с ¹⁴N в клетках появилась гибридная по плотности ДНК, у которой одна цепь была «тяжелой», а другая — «легкой». Если ДНК выделяли из клетки че­рез две генерации после такого переноса, то «гибридная» ДНК составляла лишь половину всей ДНК. В следующем поколении эта «легкая» фракция увеличивалась и составляла 75 % тотальной ДНК. Такое изменение можно объяснить только с позиций представления о полуконсервативном способе

репликации ДНК.

Сделанный Мезельсоном и Сталем вывод был пол­ностью подтвержден и для других объектов, включая животных и высшие растения. Вместе с тем оставалось не­ясным, в каком направлении происходит репликация ДНК и какие ферменты обеспечивают этот процесс. Ответ на первый вопрос удалось получить Дж.Кэрнсу (1963) в опытах на Е. сoli. Результаты опытов показали, что раскручивание двух комплементарных цепей родительской ДНК и их полуконсервативная репликация происходят практически одновременно и начинаются в общей точке начала репликации, обозначаемой как локус ori (от англ. origin — начало). Последующий анализ результатов опы­та Кэрнса и данные других экспериментов, нацеленных на изучение механизма репликации ДНК у различных бактерий, фагов, плазмид, показали, что в большинстве случаев она происходит двунаправленно и начинается, как правило, от одного уникального локуса ori. В этом месте в одной из цепей ДНК разрывается фосфодиэфирная связь, обеспечивающая последующее раскручивание дуплекса и образование особых структур — репликативных вилок, движущихся в противоположных направлениях по кольцевой ДНК. Следует, однако, отметить, что в ДНК эукариот, как правило, обнаруживается не один, а множество локусов ori, что, по-видимому, слу­жит необходимым условием для того, чтобы громадные молекулы ДНК в хромосомах эукариот успели полностью отреплицироваться за время одного клеточного цикла.

Эксперименты, проведенные на прокариотах (Е. соli, фаг Т7, некоторые плазмиды), также выявили в их ДНК (скорость репликации которых составляет около 20 мкм/мин, что в 20—30 раз выше, чем у эукариот) не по одному, а по два или даже более локусов ori.

Ферменты репликации. Как уже отмечалось, принцип комплементарности, заложенный в структуре двойной спирали ДНК, определяет возможность самокопирования генетического мате­риала. Как и большинство других биологических процес­сов, репликация ДНК обеспечивается координированной работой ряда ферментов. Важнейшие из них:

ДНК-топоизомеразы, обеспечивающие локальное рас­плетание ДНК, необходимое для инициации ее репликации и образования одиночных цепей, служащих матрицами для вновь синтезируемых дочерних молекул. Расплетенная замкнутая кольцевая молекула под действием фермента ДНК-гиразы образует сверхскрученную форму с большим запасом свободной энергии, расходуемой затем в ходе репликации;

ДНК-полимеразы, катализирующие добавление нуклеотидов к 3'ОН концу цепи ДНК;

ДНК-лигазы, сшивающие сахарофосфатный каркас молекулы.

Этапы репликации. Рассмотрим вкратце механизм осуществления основ­ных этапов репликации ДНК — инициации и элонгации. Инициация репликации происходит в локусе ori и начи­нается с появления Y-образной структуры — репликативной вилки, образование которой связано с раскручиванием дуплекса ДНК и локальным разделением ее цепей.

Поскольку две цепи дуплекса ДНК антипараллельны, синтез комплементарных им нитей должен в одном случае идти в направлении 5' — 3^', а в другом — в направлении 3^'—5^'. Первая нить называется лидирующей, вторая — запаздывающей. Как отмечалось, все_известные ДНК-полимеразы нуждаются для своей активности в свободном 3^'-ОН конце, к которому они при­соединяют нуклеотиды. В результате происходит рост цепи ДНК в направлении 5^'—3^'. Как же в таком случае осу­ществляется синтез цепи ДНК в направлении 3^'—5^'? Пред­полагалось, что для этого необходима какая-то особая ДНК-полимераза. Оказалось, однако, что синтез 3^'—5^'-цепей носит прерывистый характер.

После завершения синтеза ДНК фрагменты объединяются. Помимо рассмотренного известен еще один тип репли­кации ДНК — по способу «катящегося кольца»; так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в од­ной из цепей исходной ДНК («+»-цепь), происходит разрыв и освободившийся 5'-конец присоединяется к клеточной мембране. На 3'-конце «+»-цепи по комплементарной матрице неразорванной «—»-цепи начинается прерывистый синтез дочерней цепи. При этом проис­ходит вращение кольцевой «—»-цепи родительской моле­кулы, обеспечивающее «сползание» с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК. Осуществляется он и в случае переноса плазмидной или хромосомной ДНК от донорак реципиенту в процессе конъюгации у бактерий.

Транскрипция ДНК. Воспроизводство генетического материала обеспечи­вается репликацией ДНК, приводящей к ее самокопирова­нию в виде двух идентичных дочерних молекул. Однако проблема химических основ наследственности включает и вопрос о том, каким образом осуществляется гетерокаталитическая функция ДНК, т. е. экспрессия генов.

Сформулированная Ф.Криком так называемая цент­ральная догма молекулярной биологии утверждает, что перенос генетической информации осуществляется: 1) от ДНК к ДНК (путем репликации); 2) от ДНК через инфо­рмационную, или матричную РНК (иРНК) к белку.

Несмотря на то что в последнее десятилетие на примере РНК-содержащих вирусов была доказана возможность переноса генетической информации в направлении от РНК к ДНК с помощью процесса обратной транскрипции, основным путем экспрессии генов является их транскрип­ция, т.е. синтез одной цепи иРНК по матрице ДНК, и по­следующая трансляция этой иРНК на рибосомах, т.е. сборка аминокислот в полипептидную цепь на матрице иРНК. В клетках эукариот эти процессы отделены друг от друга в пространстве и во времени, поскольку первый происходит в окруженном ядерной мембраной ядре, откуда синтезированная иРНК поступает в цитоплазму, а затем начинает транслироваться на рибосомах. У прокариот с их плавающей в цитоплазме хромосомой (нуклеоидом) указанные процессы не разобщены и трансляция генных транскриптов, т.е. молекул иРНК, начинается до полного завершения их синтеза одновременно на многих рибосомах. Сопряженность транскрипции и трансляции у бактерий приводит к тому, что при 37 °С за 1 с синтезируется ~ 15 кодонов (т.е. триплетов нуклеотидов в иРНК, кодирующих определенную аминокислоту), а за 1 мин— 2500 нуклеотидов. Это хорошо согласуется со скоростью синтеза белка, равной при 37 °С примерно 15 аминокислот в 1 с. С момента инициации экспрессии гена его иРНК появляется в клетке через 2,5 мин, а соответствующий белок — еще через 30 с.

Этапы транскрипции. Различают три этапа транскрипции: инициацию, элон­гацию и терминацию.

Инициация. Последовательность ДНК, транскриби­рующаяся в одну иРНК, начинающаяся промотором на 5'-конце и заканчивающаяся терминатором на 3'-конце, является единицей транскрипции и соответствует совре­менному понятию «ген». Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор — фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5'—3', или слева направо. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ — первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.

Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет ряд ана­логий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3'-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

Терминация. Транскрипция завершается в специфи­ческом участке ДНК, содержащем терминирующую по­следовательность. В клетках Е. сoli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продви­гается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полиме­раза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность основа­ний, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях. Например,

5' ЦЦА ТГГ 3'

3' ГГТ АЦЦ 5'

Сплайсинг про-иРНК у эукариот. Сравнение структуры ДНК и соответствующей ей иРНК у эукариот привело к открытию прерывистого строения генов. Оказалось, что гены эукариот состоят из экзонов – последовательностей нуклеотидов, представленных в иРНК, и интронов – последовательностей, отсуствующих в иРНК. Отсюда было сделано заключение, что процесс экспрессии генов у эукариот включает этап, которого нет у бактерий: ДНК детерминирует синтез копии РНК, соответствующей последовательностям генома, однако это еще только РНК-предшественник, или про-иРНК. Непо­средственно для образования белка она не используется. Для того чтобы РНК-предшественник превратилась в транслирующуюся иРНК, она должна пройти созревание, или процессинг. Сначала из РНК-предшественника должны вырезаться последовательности, соответствующие интронным участкам. После вырезания интронов оставшиеся после­довательности РНК, соответствующие экзонам в ДНК, объединяются между собой с образованием зрелой иРНК. Этот процесс называют сплайсингом (сшиванием). Сплайсинг приводит к тому, что, хотя порядок расположения триплетов (см. ниже) в эукариотическом гене соответствует порядку расположения кодируемых ими аминокислот в белке, расстояние между триплетами внутри гена не совпадает с расстояниями между соответствующими аминокислотами в белке. В результате сплай­синга иРНК составляет по длине лишь 1/10 первоначаль­ного транскрипта. В некоторых случаях в аминокислотные последовательности транслируются не все существующие экзоны. В результате с одного гена считывается более одного типа иРНК. По мнению некоторых авторов, наличие альтернативного сплайсинга может объяснять кажущееся несоответствие между числом генов и сложностью организма, поскольку один ген может давать много разных транскриптов.

Генетический код. Синтезированная иРНК транслируется в последова­тельность аминокислот, образующую полипептидный ген­ный продукт и определяемую генетическим кодом, т.е. системой записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот различных организмов путем опре­деленного чередования последовательностей нуклеотидов. Поскольку генетический код читается по иРНК, он запи­сывается с помощью четырех оснований РНК (А, Г, Ц, У). Расшифровка заключенного в ДНК генетического кода — крупнейшее достижение биологии XX в., равное по значению открытию генетической роли ДНК и ее строе­ния. Идея о том, что гены контролируют структуру обра­зующихся в организме белков, была высказана еще в 1904 г. английским врачом-биохимиком А.Гарродом, изу­чавшим некоторые врожденные нарушения обмена ве­ществ у людей. 0дно из таких нарушений — алкаптонурия. Гаррод, намного, опередив свое время, сумел понять, что этот дефект связан с блокированием нормального пути метаболизма указанных аминокислот и наследуется в виде одиночного рецес­сивного гена. Таким образом, впервые была высказана мысль о том, что между генами и метаболическими реакциями организма существует взаимосвязь. Спустя 30 лет Бидл и Татум облучали неполовые споры (конидии) нейроспоры рентгеновскими либо УФ-лучами, для того чтобы индуцировать мутации в её ДНК. Генетический анализ показал, что в отобранных клонах мутация каждый раз происходила только в одном гене. В связи с этим было сделано заключение: одна мутация приводит к потере одной метаболической активности, и, следовательно, один ген кодирует один фермент. Один ген – одна полипептидная цепь, вывод Бидла и Татума (1941) заложил основу современной биохимической генетики. Общие свойства кода были выявлены генетическими методами путем изучения молекулярных закономерностей образования мутаций. Они сводятся к следующему: 1) ге­нетический код универсален (т.е. идентичен в основном для всех живых организмов); 2) триплетен (т.е. каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами); 3) не перекрывается (т.е. соседние триплеты не имеют общих оснований); 4) не содержит каких-либо разделительных знаков между отдельными триплетами (код без запя­тых); 5) имеет линейный порядок считывания и характе­ризуется колинеарностью, т.е. совпадением порядка рас­положения кодонов в иРНК с порядком кодируемых ими аминокислот в синтезирующемся белке; 6) является вы­рожденным, или избыточным, так как все аминокислоты (за исключением метионина и триптофана) имеют более одного кодона; 7) из трех нуклеотидов кодона преимущест­венное значение имеют два первых, третий может варьиро­вать; 8) в среднем каждая аминокислота кодируется тремя триплетами; 9) число кодонов для каждой аминокислоты (кроме аргинина) коррелирует с частотой ее встречае­мости в белках; 10) частота использования различных кодонов для включения одной и той же аминокислоты может быть видоспецифичной. Для пунктуации генети­ческой информации во время ее трансляции имеют значе­ние пять кодонов. Кодоны АУГ и ГУГ называются иниции­рующими. Они определяют правильное начало синтеза генного продукта при трансляции иРНК. Эти кодоны располагаются на границе последовательностей иРНК, списы­ваемых с регуляторной и структурной частей гена. Они указывают точку, от которой начинается синтез полипептидной цепи, поскольку регуляторная часть гена не транс­лируется. Если те же кодоны располагаются в структурной части гена (за редким исключением, связанным с особен­ностями кода в митохондриях), они теряют свое иниции­рующее значение и направляют включение метионина или валина соответственно. Помимо двух инициирующих код содержит три терминирующих, или нонсенс (бессмыслен­ных), кодона (УАА, УАГ и УГА), определяющих оконча­ние синтеза полипептидной цепи.

Трансляция иРНК. Рибосомы. Биосинтез белка осуществляется путём трансляции иРНК рибосомами – структурами, локализованными у эукариот в цитоплазме, часто на разветвлённой внутриклеточной мембранной сети, называемой эндоплазматическим ретикулумом. У прокариот рибосомы разбросаны по всей клетке. Рибосомы состоят примерно из 50 белков и 3—5 молекул рРНК, различающихся по молекулярной массе. Размер рибосом обычно обозначают в единицах Сведберга (5), отражающих скорость их осаждения при центрифугировании. Независимо от происхождения рибосомы состоят из двух субъединиц. У Е. соli рибосомы имеют коэффициент седиментации 70S, а более крупные рибосомы эукариот — 80S. Поскольку в клетках как про-, так и эукариот число рибосом очень велико, гены rrn, кодирующие рРНК, представлены в ДНК во многих копиях. Так, у Е. соli имеется по 5-10 копий таких генов, локализованных в трех различных районах хромосомы. У эукариот гены, кодирующие синтез рРНК, представлены в сотнях и даже тысячах копий и тандемно повторяются (т.е. расположены непосредственно друг за другом) в районе ядрышкового организатора определенных хромо­сом либо сгруппированы в виде тандемных повторов в дру­гих участках генома.

Информационная РНК. Как отмечалось, многие прокариотические иРНК полицистронны, т.е. содержат последовательности, детермини­рующие синтез нескольких полипептидов. Поэтому такие иРНК содержат серию старт (инициирующих) - и стоп (тер­минирующих) –кодонов.

В отличие от короткоживущих прокариотических иРНК в клетках млекопитающих около 50% иРНК имеют период полураспада около 6 ч и более. Особенно стабильна эукариотическая иРНК в дифференцированных клетках, син­тезирующих специальные белки. У эукариот иРНК всегда списывается с одного, а не сразу с нескольких генов, организованных у прокариот в опероны.

У эукариот, так же как у бактерий, иРНК составляет всего 3% от всей клеточной РНК.

Транспортные РНК. В раскрытии механизма трансляции важную роль сыг­рала предложенная Криком (1958) гипотеза, согласно которой распознавание аминокислот в процессе синтеза белка происходит не прямо путем взаимодействия между ними и соответствующими кодонами в иРНК, а с участием промежуточных молекул — адаптеров. Такие молекулы действительно вскоре были открыты. Ими оказались тРНК. Эти небольшие (4S) молекулы длиной 75-85 нуклеотидов имеют характерную вторичную структуру в форме листа клевера.

«Распознавание» кодона антикодоном контролируется рибосомами. Рибосомы движутся вдоль иРНК в направлении 5^'- 3^', считывая кодоны путём присоединения к ним аминоацил –тРНК, несущих соответствующие антикодоны. К каждой иРНК присоединяется одновременно несколько рибосом, располагающихся вдоль её молекулы на расстоянии примерно 90 нуклеотидов друг от друга. Такой трансляционный комплекс называют полирибосомой или полисомой. У бактерий полисомы намного крупнее, чем у эукариот. Это, в частности, связано с тем, что у прокариот иРНК имеют большую длину (особенно в случае полицистронной иРНК). Присоединение рибосом к иРНК происходит до окончания транскрипции. У Е. сoli каждая иРНК транслируется сразу 30 рибосомами в отрезке вре­мени между ее транскрипцией и деградацией. У эукариот обычно к одной иРНК присоединяется менее 10 рибосом одновременно. В среднем у обеих групп организмов полиcомы соответствуют величине синтезируемого полипептида.

Этапы трансляции. Процесс трансляции подразделяют на три стадии: ини­циацию, элонгацию и терминацию. Стадия инициации включает все реакции, осуществляющиеся до формирова­ния пептидной связи между первыми двумя аминокисло­тами. У Е. coli от инициации транскрипции гена до появле­ния в клетке его иРНК проходит ≈ 2,5 мин, а соответствую­щего белка — еще ≈ 30с. Инициация синтеза полипептидной цепи происходит в момент формирования комплекса между иРНК, 30S субъединицей рибосомы и формилметионил-тРНК.

Стадия элонгации включает все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения к синтезирующемуся полипептиду последней аминокисло­ты. У прокариот этап элонгации идет очень быстро; как отмечалось, при 37 °С в полипептид за 1 с включается в среднем 15 аминокислот. Следовательно, если исходить из того, что средний размер гена составляет 1000 п.н., синтез кодируемого им белка из 300 аминокислот осуществляется всего за 20с. При этом в синтезе белка участвует одновре­менно до 80% всех клеточных рибосом. У эукариот скорость синтеза белка существенно ниже: за 1 с при 37 °С в цепь включаются лишь ≈ 5 аминокислот. На стадии терминации трансляции полностью синтезированный поли­пептид освобождается от концевой тРНК, а рибосомы отходят от иРНК.

Сформировавшийся в ходе трансляции полипептид полностью соответствует (колинеарен) кодирующему его гену.

16. Искусственный синтез генов. В сов­ременной генетике применяются два способа искусственного синтеза генов вне организма — химический и ферментативный. Впервые синтез гена был осу­ществлен химическим путем в 1969 г. работающим в Америке индийским уче­ным Хораной с сотрудниками. Этим рукотворным геном был небольшой по размеру (77 пар нуклеотидов) ген аланиновой тРНК дрожжей, последова­тельность нуклеотидов в котором была к тому времени полностью расшифрова­на. Руководствуясь этой последовательностью, группа Хораны химически син­тезировала мелкие фрагменты ДНК (от 4 до 13 пар нуклеотидов) и соединила их в нужном порядке с помощью лигазы. Изготовленный таким образом ген не имел регуляторных элементов и был функционально неактивным.

Развивая это направление и приме­няя те же методы, Хорана со своими помощниками синтезировали в 1976 г. отрезок ДНК кишечной палочки, содержащий ген супрессорной тирозиновой тРНК длиной 126 пар нуклеотидов, и примыкающие к нему промотор (52 па­ры нуклеотидов) и терминатор (21 пара нуклеотидов), а также прикрепленные к концам отрезка тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. На этот раз искусственно созданный ген вместе с этими добавочными элементами оказался полностью работоспособным, что проявилось, когда синтезированный отрезок был встроен в геном мутантного фага Т4. Этот фаг содержал нонсенсмутацию, вследствие которой в транс­крибируемой с его генома матричной РНК триплет УАЦ, кодирующий ти­розин, превратился в УАГ т.е. в стоп-сигнал, обрывающий рост полипептидной цепи, почему этот мутантный фаг не может размножать­ся в нормальных клетках кишечной палочки. В присутствии такой тРНК происходит по­давление (супрессия) нонсенс-мутации фага Т4 и он приобретает способность размножаться в нормальных бактери­альных клетках, что и произошло после встраивания в геном мутантного фага искусственно синтезированного отрез­ка ДНК с геном супрессорной тирозиновой тРНК.

Другим примером искусственного создания функционально-активного ге­на служит химический синтез неодно­кратно упоминавшегося в лекциях оператора лактозного оперона кишеч­ной палочки. Синтезированный в про­бирке оператор был встроен в плазмиду, с помощью которой его удается ввести в бактерию. Когда в бактерию, у которой лактозный оперон заблоки­рован вырабатываемым в ней репрессором, вводят одновременно несколько таких плазмид, несущих искусственно синтезированные операторы, то коли­чества образуемого в клетке репрессора не хватает, чтобы связаться со всеми оказавшимися в ней операторами лак­тозного оперона. Оперон этот дерепрессируется, его структурные гены начи­нают работать, обеспечивая синтез ко­дируемых ими ферментов, и кишеч­ная палочка приобретает способность усваивать лактозу.

Эти блестящие результаты, достиг­нутые длительной кропотливой работой, показали возможность создания в про­бирке генов, вполне тождественных природным, однако следует отметит, что синтезированные гены относятся к наиболее мелким из известных; изго­товление же генов, кодирующих белки и состоящие из тысячи или более нуклеотидных пар, пока представляют для химического метода слишком сложную задачу. Искусственный синтез таких генов стал возможен благодаря откры­тию обратной транскрипции с РНК на ДНК. Изучение транскрипции показало, что матрицей для образования ДНК-вых копий может служить не только РНК онкогенных вирусов, в опытах с которыми это явление было открыто, но и разные другие РНК, в том числе даже синтетические полирибонуклеотиды. Обратная транскриптаза добросовестно строит на всех таких матрицах их ДНК-копии. Это сделало принципиально осуществимым искус­ственный ферментативный синтез лю­бых индивидуальных генов (притом в числе копий) путем транскрибирования их с соответствующих РНК.

15. Модель оперона. Исследование механизмов регуляции генов, кодирую­щих утилизацию молочного сахара лактозы у Е. соli, позволило Ф.Жакобу и Ж.Моно (1961) предложить модель координированного контроля работы структурных генов, известную как модель оперона. Согласно этой мо­дели в ее нынешнем виде, транскрипция группы структур­ных генов, кодирующих полипептиды, тесно связанные между собой функционально, регулируется двумя контролирующими элементами — геном-регулятором и операто­ром. Последний представляет собой последовательность нуклеотидов, примыкающую к регулируемым структурным генам. Если продуктом гена-регулятора является белок-репрессор, его присоединение к оператору блокирует транскрипцию структурных генов, создавая стерические препятствия для присоединения РНК-полимеразы к спе­цифичному участку-промотору, необходимому для инициации транскрипции. Напротив, если белком-регулятором служит активный апоиндуктор, его присоеди­нение к оператору создает условия для инициации транс­крипции. Оператор часто локализуется между промотором и структурными генами. Последовательность ДНК, состоя­щая из тесно сцепленных структурных генов, оператора и промотора и образующая единицу генетической регуляции, называется опероном. Ген-регулятор может локализо­ваться рядом с опероном или на расстоянии от него. В регу­ляции работы оперонов участвуют также низкомолекуляр­ные вещества —эффекторы, выступающие как индукторы либо корепрессоры структурных генов, входящих в состав оперонов.

Различают индуцируемые и репрессируемые опероны в зависимости от типа влияния на их работу молекул-эффекторов. У индуцируемых оперонов эффек­тор присоединяется к белку-репрессору и блокирует его связывание с оператором, препятствуя транскрипции структурных генов. Такой тип регуляции работы оперона называют негативным. Наряду с этим индуцируемые опероны могут находиться под позитивным контролем регуляции, при котором эффектор связывается с регуляторным белком и активирует его. Активный апоиндуктор присоеди­няется к оператору, что обеспечивает возможность транс­крипции оперона. Оба типа контроля регуляции дейст­вуют и в отношении репрессируемых оперонов. При негативном контроле эффектор, являющийся корепрессором, присоединяется к неактивному репрессору и активирует его. В результате репрессор приобретает способность при­соединяться к оператору и тем самым блокировать транс­крипцию оперона. При позитивном контроле функциониро­вания репрессируемого оперона корепрессор связывается с активным апоиндуктором. Такой комплекс не может при­соединяться к оператору, и структурные гены не транскри­бируются.

Таким образом, при негативном контроле эффектор связывается с репрессором, что приводит к его инактива­ции либо активации и соответственно индуцирует либо репрессирует транскрипцию оперона. При позитивном контроле эффектор присоединяется не к репрессору, а к апоиндуктору, что разрешает, или, напротив, блокирует транскрипцию в зависимости от того, какую форму (актив­ную или неактивную) приобретает апоиндуктор в резуль­тате связывания с эффектором. Поскольку при транскрип­ции оперона, состоящего из нескольких структурных генов, образуется один общий транскрипт в виде молекулы полицистронной иРНК, все эти гены экспрессируются коорди­нировано.

Оперон, обеспечивающий у Е.соli способность к сбраживанию молочного сахара — лактозы, состоит из промо­тора, оператора и трех структурных генов. Ген lac Z кодирует фермент β-галактозидазу, катализирующую гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы; ген lac Y -галактозидпермеазу, обеспечивающую транспорт различных сахаров включая лактозу, мелибиозу и рафинозу в клетку; ген lac А - тиогалактозидтрансацетилазу, роль которой в утилизации лактозы не ясна. Все три белка обычно присутствуют в клетках Е.coli в следовых количествах. Однако при выращивании бактерий на среде, в ко­торой единственным источником углерода и энергии служит лактоза, количество указанных ферментов увеличивается в 1000 раз.

В качестве индукторов могут служить различные соединения. Лактоза представляет собой индуктор и одновременно субстрат. Транскрипция lac-оперона контролируется двумя элементами: небольшой молекулой- эффектором, циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) и белком-активатором САР (от первых букв англ. catabolite activator protein — белок-активатор катаболизма), называемым также белком-рецептором цАМФ.

В структуре промотора lac-оперона выявлено два сайта связывания. Один из них взаимодействует с РНК-полимеразой, другой — с комплексом САР-цАМФ. Присоединение комплекса САР-цАМФ к своему сайту на промоторе — условие индукции оперона. Следовательно, этот комплекс позитивно контролирует транскрипцию lac-оперона. Белок САР состоит из двух идентичных субъединиц с общей М_r≈45000, кодируемых геном cap, или crp.

Таким образом, транскрипция lac-оперона на самом деле находится под двойным — негативным и позитив­ным — контролем. Комплекс САР-цАМФ позволяет РНК-полимеразе присоединиться к матричной ДНК до начала транскрипции. Репрессор — продукт гена lacI — препят­ствует инициации синтеза иРНК.

В настоящее время расшифрована полная нуклеотидная последовательность регуляторной области lac-оперона, включающая промотор и оператор.

Выяснение структурной организации оператора lac-оперона показало, что существенную роль во взаимодействиях мультимерных белков типа lac-репрессора или РНК-полимеразы с ДНК играют симметричные структуры - палиндромы. Оператор lac-оперона состоит из 26 п.н., из кото­рых 14 представляют собой палиндром: в различных цепях они читаются одинаково, но в противоположных направле­ниях. Палиндром обнаружен и в участке промотора, свя­зывающемся с комплексом САР-цАМФ.

Лактозный оперон Е.coli — пример негативной регуля­ции транскрипции в случае индуцируемых генов. Рассмот­рим теперь, как действует система негативного контроля в случае репрессированного оперона на примере группы генов, детерминирующих биосинтез аминокислоты гистидина у S.typhimurium. Гистидиновый (his) оперон состоит из девяти структурных генов (his E, I, F, A, H, B, C, D, G), порядок расположения которых не соответствует очеред­ности осуществления кодируемых ими этапов метаболизма гистидина, и прилегающей к ним справа операторной последовательности (О). Особенностью регуляции his-оперона является участие корепрессора, в отсутствие кото­рого указанные структурные гены транскрибируются. Этим корепрессором служит особым образом модифицирован­ная гистидиновая тРНК. Активный корепрессор обра­зуется под контролем пяти генов, не сцепленных друг с другом и с his-опероном. Мутации в любом из этих генов-регуляторов (his R, S, T, U, W) приводят к конститутив­ному синтезу ферментов биосинтеза гистидина. Таким образом, в случае his-оперона отсутствует продукт-репрессор, непосредственно выключающий транскрипцию струк­турных генов путем присоединения к оператору. Вместо одного гена-регулятора имеется целых пять генов, мутации в которых снижают концентрацию и активность корепрес­сора, способного присоединяться к оператору, блокируя тем самым транскрипцию структурных генов his-оперона. Истинного репрессора -his-оперона не найдено.

Триптофановый оперон обладает важными особенностями, характерными и для других бактериальных оперонов, контроли­рующих биосинтез аминокислот. Регуляция биосинтеза триптофана осуществляется на трех уровнях. Первый из них связан с ингибированием конечным продуктом, не затрагивающим непосредственно активность генов. Суть этого феномена состоит в том, что один из продуктов био­синтетической цепи, обычно конечный, подавляет актив­ность продуктов-предшественников.

Второй тип регуляции биосинтеза триитофана осуществляется на уровне взаимодействия репрессора с оператором. В отличие от оперонов, определяющих утилизацию сахаров, цАМФ и белок САР не участвуют в регуляции оперонов, детерминирующих биосинтез аминокислот. Вто­рое отличие состоит в том, что молекула-эффектор не индуцирует генную активность в результате отсоединения репрессора от оператора, а, напротив, подавляет функцио­нирование структурных генов вследствие присоединения к оператору апорепрессора. Последний представляет собой комплекс репрессора с конечным продуктом всего биохи­мического пути, т.е, в данном случае с триптофаном. Таким образом, триптофан обеспечивает оба уровня регуляции собственного биосинтеза. С одной стороны, он действует как аллостерический ингибитор фермента антранилатсинтетазы, а с другой — входит в состав апорепрессора, бло­кирующего транскрипцию оперона. При избытке триптофана в среде апорепрессор подавляет образование иРНК, что снижает уровень продукции ферментов биосинтеза триптофана примерно в 70 раз.

формы регуляции генной активности у про- и эукариот. Генная активность может регулироваться в процессе развития организма. Известно, например, что у человека каждая молекула гемоглобина состоит из двух полипептидов типа α и двух типа β. Полипептид типа α состоит из двух цепей - ζ и α. Обе цепи кодируются дуплицированными генами (ζ₁, ζ₂ и α₁, α₂). Гены ζ актируются в раннем эмбриогенезе, гены α - преимущественно у плодов и у взрослых организмов. Полипептиды типа β пред­ставлены субъединицами ε, γ, δ, β. Кодирующие их гены расположены в 11-й хромосоме, причем также в порядке их экспрессии. Ген ε экспрессируется у эмбрионов, γ — у плодов, δ и β - у взрослых особей. Однако ген δ экспрессируется плохо, поэтому у взрослых гемоглобин состоит из четырех цепей α₂β₂.

Модификации ДНК, главным образом метилирование цитозина, также влияют на действие генов. Например, активные гены гемоглобина менее метилированы, чем неактивные.

Примеры регуляции на генном уровне — различные случаи программированных количественных изменений ДНК.

Примером регуляции, обусловленной транспозицией служит феномен переключения типов спаривания у дрожжей, который будет рассмотрен.

Регуляция, связанная со сплайсингом ДНК, изучена на примере генов, кодирующих синтез антител. Сплайсинг обеспечивает сшивание консервативных (т.е. постоянно присутствующих) районов этих генов с различными варьи­рующими. Подобный механизм лежит в основе разнообразных комбинаций последовательностей, в результате чего появляется большое число типов антител, поскольку любая консервативная область может быть присоединена к любой варьирующей.

Регуляция на уровне процессинга РНК обес­печивает возможность образования зрелой, функционально активной иРНК.

Экспрессия генов на уровне посттрансляционной моди­фикации полипептидов регулируется путем расщепления различных белков-предшественников на их конечные функционально активные продукты.

Рассмотренные примеры свидетельствуют о многообра­зии способов реализации генетической информации путем регуляции активности самих генов либо их продуктов. Следует, однако, отметить, что для клетки наиболее эко­номична регуляция на уровне транскрипции, поскольку она препятствует образованию соответствующих иРНК и белков, когда клетка не испытывает в них потребности. Вместе с тем регуляция на уровне транскрипции идет срав­нительно медленно, тогда как, например, активация бел­ков путем расщепления молекул-предшественников хотя и неэкономична, но происходит очень быстро.