Введение 3 страница. Н – неокрашенные клетки и агрегаты.

н – неокрашенные клетки и агрегаты.

Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КЛОНОВ НА АГАРИЗОВАННЫХ СРЕДАХ. МЕТОД ПЛЕЙТИНГА.

Объяснение. Культивирование отдельных (одиночных) клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость клонового материала. Одиночные клетки или изолированные протопласты используются в клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. В эти клетки можно ввести новые гены, в то же время – это хорошая модель для изучения онтогенеза и физиологии клетки.

Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие на жидкой питательной среде; мацерированные ткани растений (мезофилл листа); изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки.

Наиболее эффективными методами для получения одиночных клеток являются: метод «кормящего слоя» или «культуры-няньки», кондиционированных сред, микрокапель. Для получения генетически стабильных клонов и клеточной селекции используется метод плейтинга.

Материалы и оборудование. Колбы с суспензией, стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, чашки Петри с агаризованной средой, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, 96 % спирт.

Ход работы.

1. Пипеткой отобрать 5 мл верхней фракции суспензии (в верхнем слое суспензии преобладает фракция одиночных клеток) и смешать с 5 мл агаризированной (1,4 % агара) среды для культивирования каллуса. Работу проводить в стерильной посуде: мерном цилиндре, стакане.

2. Полученную смесь разлить в стерильные чашки Петри слоем до 1 см.

3. Чашки Петри закрыть крышками и герметизировать парафином.

4. Количество колоний подсчитать через 4-6 недель.

5. Результаты зарисовать, подсчитать плотность высева по формуле:

количество образовавшихся колоний

Эффективность высева = ´ 100 %

количество высеянных клеток

Контрольные вопросы к теме IV.

1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения?

2. Как определить степень агрегированности и жизнеспособности суспензий?

3. Как подсчитать плотность суспензии?

4. Каковы основные способы культивирования одноклеточных суспензий?

5. В каких отраслях производства и науки используют суспензионные культуры?

ТЕМА V. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ.

Работа 1. Индукция органогенеза и соматического
эмбриогенеза в каллусной ткани табака под действием фитогормонов.

Объяснение. Фитогормоны – это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.

По химической природе гормоны растений четко подразделяются на две группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины, абсцизины, брассины, фузикокцин, цитокинины), производные аминокислот (ауксины –из триптофана, этилен – из метионина и аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в апексах побегов образуется ИУК– индолил-3-уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов – каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах корней синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня – гиббереллины, источником зеатина является эндосперм проростающих семян.

По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях – деление клеток, в сочетании с цитокининами – органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-З-масляная кислота), ИПК (индолил-З-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная кислота)].

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим – 6-БАП (6-бензиламинопурин).

Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.

Абсцизины (АБК – абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).

Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования ДНК и таким образом регулируют экспрессию генов, но и связываются с белками – репрессорами на опероне, что приводит к активации структурных генов и синтезу определенных ферментов. Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дедифференциация, редифференциация и дифференциация клеток и тканей.

Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами табака, колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза, флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.

Ход работы.

1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5х5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.

2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 + 2^оС, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5кLх.

4. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.

Работа 2. Индукция деления клеток и роста клеток
растяжением под действием ауксина и гиббереллина.

Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.

В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.

В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Фитогормоны способны изменять проницаемость клеточных мембран. Под действием ауксинов и гиббереллинов усиливается выброс протонов из клетки, что приводит к подкислению клеточной стенки и ослаблению связей между целлюлозными фибриллами в результате частичного кислотного гидролиза пектиновых веществ. Поэтому клеточная стенка становится более эластичной и под действием тургорного давления вакуоли клетка приобретает способность к растяжению.

Материалы и оборудование. Семена пшеницы и тритикале, колбы с дистиллированной водой, 6 % хлорамин, чашки Петри с растворами гормонов, стерильные пинцеты, спиртовки, 96% спирт, ламинар-бокс.

Ход работы.

1.Отобрать 30 здоровых семян пшеницы или тритикале.

2. Семена простерилизовать в растворе хлорамина в течение 5 минут.

3. Промыть семена автоклавированной водой 3 раза.

4. Стерильным пинцетом поместить семена в чашки Петри с дистиллированной водой, раствором 2,4-Д (5-10 мг/л), раствором гибберелловой кислоты (2-4 мг/л).

5.Закрыть чашки Петри и поместить в термостат при температуре 25 + 2^оС и влажности воздуха 70 %.

6.Результаты опыта зарисовать через 2-4 недели.

Контрольные вопросы к теме V.

1. Что такое фитогормоны, и какие процессы в растительных клетках и тканях они стимулируют?

2. Какие группы фитогормонов стимулируют и ингибируют рост и развитие растений?

3. Как осуществляется гормональная регуляция в культуре клеток и тканей?

4. Какова химическая природа фитогормонов, и в каких органах растения они синтезируются?

5. Каким образом гормональная система влияет на генетический аппарат клетки?

ТЕМА VI. КУЛЬТУРА ГАПЛОИДНЫХ КЛЕТОК.

Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни
и яблони.

Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.

Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.

Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4-6^о С в течение 2-8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2^о С.

]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидныи зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.

Ход работы.

1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5-6 раз) стерильной дистиллированной водой.

2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.

3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.

4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26^о С и влажностью 70 %.

5. Результаты работы зарисовать через 2-4 недели.

Работа 2. Получение растений-регенерантов из пыльцевых каллусов вишни.

Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин – 0,1-0,3 мг/л, ГК – 4 мг/л, 6-БАП – 0,5-1,5 мг/л, ИУК – 0,5-1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2-3 кLх.

Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, молочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.

Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.

Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин – 1-2 мг/л, 6-БАП – 3-6 мг/л, аденин – 1-2 мг/л, ГК – 1-2 мг/л, феруловая кислота – 0,5-0,7 мг/л, ИУК – 0,2-0,4 мг/л, НУК – 0,2-0,4 мг/л, ИМК – 0,2-0,4 мг/л, 2,4-Д – 0,1-0,3 мг/л.

Через 1,5-2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 кLх начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4-6 недель.

Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.

Ход работы.

1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).

2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5-6 мм) морфогенного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.

3.Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2^о С, влажностью 70 %, освещенностью 4 кLх.

4. Через 4-6 недель зарисовать результаты работы.

5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1-2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НУК.

6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1-2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.

Контрольные вопросы к теме VI.

1. Для чего используются гаплоиды в селекции и генетике?

2. Как получить морфогенный каллус из пыльников?

3. Каковы основные способы получения гаплоидных и дигаплоидных растений-регенерантов?

ТЕРМИНОЛОГИЯ

In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.

Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма.

Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.

Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.

Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.

Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.

Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.

Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.

Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.

Апекс – верхушечная часть стебля или корня.

Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.

Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.

Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.

Фитогормоны – (гормоны растений)– биолигически активные соединения, образующиеся в раститениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.

Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.

Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие меристем, стимулирующие образование почек.

Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вызывающие прорастание семян.

ГК – гибберелловая кислота

ИУК – b-индолилуксусная кислота

НУК – a-нафтилуксусная кислота

2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

6-БАП – 6-бензиламинопурин

Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro).

Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих.

Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).

Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.

Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками.

Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других.

Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro.

Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней.

Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа.

Эмбриоидогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro.

Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in vitro путем неорганизованной пролиферации.

Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток, тканей, органов растений.

Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных средах без гормонов.

Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в культуральный сосуд на свежую питательную среду.

Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма или каллусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивирования.

Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмического роста), замедления роста, стационарная, деградации.

Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса.

Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.

Клон – культура, возникшая из одной клетки.

Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.

Сомаклональные вариации и варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка-растение-клетка.

Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибридных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла, например путем слияния изолированных протопластов.

Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного или механического разрушения.

Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший при фрагментации изолированного протопласта.

Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплазмы, сохранивший ядро.

Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.

Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты превращаются в культуру клеток.

Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изолированных протопластов.

Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеированным протопластом.

Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида.

Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным числом хромосом в полиплоидной серии (символ Х).

Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду
(символ n).

Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного вида (символ 2n).

Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу.

Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным основным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.).

Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х.

Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х.

Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности организма.

Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом несут данные гены.

Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомологичные наборы имеют разные гены.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1.

Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4.	KNO3 NH4NО3 KH2PO4 MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный	3,4 7,4 3,6
5.	CaCl2 . 2H2O или CaCl2 безводный	8,8 6,65
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6. 7. 8. 9.   10. 11. 12.	Na2MoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O H3BO3 MnSO4 . 5H2O или MnSO4 . 4H2O ZnSO4 . 7H2O KJ CoCl2 . 6H2O	2,5 2,5
13.	FeSO4 Na2 ЭДТА

Таблица 2

Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Мезоинозит Глицин Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 30 г/л
рН 5,6-5,8

Таблица 3

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для
культивирования апикальных меристем картофеля

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Витамин В12 Никотиновая кислота Фолиевая кислота Мезоинозит Гидролизат казеина Аденин Пантотенат Са Рибофлавин Биотин Активированный уголь ГК Кинетин Сахароза Глюкоза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 0,015 мг/л 2 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 1 г/л 40 мг/л 10 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 10 г/л 2 мг/л 0,5 мг/л 20 г/л 20 г/л 7 г/л
рН 5,7-5,8

Таблица 4

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для
микроразмножения картофеля черенкованием побегов

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аденин Кинетин Гибберелловая кислота Пантотенат Са	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 40 мг/л 0,5 мг/л 2 мг/л 10 мг/л

Продолжение таблицы 4

Активированный уголь Сахароза Агар-агар	10 г/л 30 г/л 7 г/л
рН 5,8

Таблица 5

Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.