Опыт 1. Пристеночное пищеварение

Цель опыта: показать значение сорбирования ферментов на мембранах клеток слизистой кишечника в пищеварении.

Порядок проведения работы.

1.Кусочек слизистой оболочки верхней четверти тонкой кишки крысы весом 10-15 мг поместить в стаканчик Хагедорна, в который налито 4 мл охлажденного раствора Рингера

(t +3,5 градусов). Встряхивая в течение 30 секунд, смывают амилазу, которая не была сорбирована на поверхности кишки. Эта фракция (амилаза С) участвует в полостном пищеварении и используется как показатель полостного пищеварения.

2.Кусочек отмытой слизистой перенести в ступку и проводят его гомогенизацию в 4 мл раствора Рингера. Гомогенизат перелить в стаканчик Хагедорна и встряхивать 5 минут. Так отмывается фракция амилазы гомогената (Г-амилаза), которая характеризует мембранное пищеварение.

3.Профильтровать экстракты С и Г фракции амилазы и определить в них амилолитическую активность по методу Вольгемута (определяется убыль крахмала при ферментативном гидролизе по изменению окраски йодо-крахмальных комплексов (по мере убыли крахмала синяя окраска постепенно слабеет и исчезает).

Ход определения амилолитической активности: В 2 штатива поставить 6-8 пробирок, в которые налить по 1 мл р-ра Рингера, затем в 1-ню пробирку одного штатива добавить 1 мл экстракта, содержащего фракцию С-амилазы, а в 1-ую пробирку 2 штатива - 1 мл экстракта, содержащего фракцию Г-амилазы. После встряхивания пробирок 1 мл смеси последовательно переносят в следующую пробирку, вновь встряхивают и т.д. Из последней пробирки 1 мл смеси выливают. Т.о. получен ряд разведений в 2 раза. Затем в пробирки налить по 2 мл 1% р-ра крахмала и поместить пробы в водяную баню при t 38 градусов на 30 минут, после чего реакцию остановить добавлением во все пробирки по 1 мл

1%р-ра соляной кислоты. Затем во все пробирки прилить по 1 капле иодного раствора. Активность амилазы рассчитывается по разведению фермента в последней пробирке, которая не отличается по окраске от контроля (в контроле имеются все компоненты, кроме амилазы, ее заменяет 1 мл р-ра Рингера). Результат выражается в условных единицах Вольгемута, характеризующих степень разведения.

Пример:4-я пробирка -16 единиц; 5-я32 ед.и т.д. После определения амилолитической активности С и Г фракций находят отношение мембранного пищеварения (М) к полостному (С) М/С. В норме эта величина больше 2,5-3. Оформить протокол. Сделать вывод о значении мембранного пищеварения.