Непосредственная постановка реакции

1. Забивают мышей и фиксируют их на столике.

2. Выделяют селезенку.

3. Готовят суспензию клеток в 3 мл среды 199 и подсчитывают число ядросодержащих клеток в суспензии.

4. Готовят разведение клеток с концентрацией 50x10⁶ и 10x10⁶ в 1 мл.

5. Готовят смесь агара, эритроцитов барана и клеток селезенки. Для этого в пробирки с 2 мл агара, находящиеся в водяной бане при 45 °С, добавляют 0,1 мл 10% суспензии эритроцитов барана и 0,1 мл суспензии клеток (конечная концентрация клеток - 5x10⁶ и 1x10⁶).

6. Разливают смесь в чашки Петри. Смесь из пробирок выливают на теплые чашки Петри. Быстрыми круговыми движениями смесь равномерно распределяют по дну чашки. Чашки ставят на горизонтальный столик. Дают агару застыть.

7. Инкубируют чашки Петри в термостате при 37 °С в течение 60 мин.

8. Разведение комплемента: сухой комплемент морских свинок разводят средой 199 (на 1 ампулу 5 мл среды, получают 20% раствор).

9. В каждую чашку Петри аккуратно добавляют по 3 мл комплемента.

10. Инкубируют чашки Петри в течение 30 мин при 37 °С.

11. Оценивают реакцию.

12. Подсчитывают число бляшкообразующих клеток на чашку и пересчитывают на 1 млн клеток и на всю селезенку.

13. Микроскопия бляшек: находят бляшку с лизированным участком и бляшкообразующей клеткой в центре.

14. Для улучшения контрастирования бляшек производят окраску препаратов (состав красителя: 10 мл 2% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте, 10 мл 5% H₂O₂, 80 мл дистиллированной воды).

15. Для сохранения бляшек чашку Петри заливают 10% раствором формалина.

3.5. КУЛЬТУРА КЛЕТОК IN VIVO