Вакцины 243

зуемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител.

Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella. При этом было известно, что эпитоп, включающий 50—64 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-10⁶ живых или убитых формалином бактерий с модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (50—64 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину.

С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой, и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E. coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella. В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella, в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB, можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные патогенные микроорганизмы (бактерии или вирусы). Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности; аттенуированные штаммы нередко ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполной; срок годности вакцины зависит от условий ее хранения.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунолога-чески активные штаммы, которые не могут

244 ГЛАВА 11

ревертировать и становиться патогенными. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец, гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субъединичные и пептидные вакцины (если используются полноразмерные гены в первом случае и фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант — во втором). Пептидные вакцины получают и с помощью химического синтеза пептидов.

ЛИТЕРАТУРА

Andio R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso,

C. J. Miller, D. Baltimore, M. B. Feinberg. 1994. Engineering poliovirus as a vaccine vector for the expression of diverse antigens. Science 265: 1448-1451.

Bittle J. L., R. A, Houghten, H. Alexander, T. M. Shinnick, J. G. Sutcliffc, R. A. Lernen,

D. J. Rowlands, F, Brown. 1982. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence. Nature 298: 30-33.

Blancou J., M. P. Kieny, R. Lathe, J. P. Lecoq, P. P. Pastoret, J. P. Soulebot, P. Desmettre. 1986. Oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia vaccine. Nature 322: 373-375.

Blasco R., B. Moss. 1995, Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation. GeneW: 157-162.

Boothroyd J. C., P. E. Highfîeld, G. A, M. Cross, D. J. Rowlands, P. A. Lowe, F. Brown, T. J. R. Harris. 1981. Molecular cloning of foot and mouth disease virus genome and nucleotide sequences in the structural protein genes. Nature 290: 800-802.

Brown Г. 1984. Synthetic viral vaccines. Annu. Rev. A/kro&O/. 38:221-235.

Brown F. 1985. Peptides as the next generation of foot-and-mouth disease vaccines. Bio/Techno-logy 3:445-448.

Burnette W. N. 1990. The advent of recombinant pertussis vaccines. Bio/Technology 8: 1003-1005.

Charles L, G. Dougan. 1990. Gene expression and the development of live enteric vaccines. Trends Biotechnol. 8:117-121.

Chatfield S. N., I. G. Charles, A. J. Makoff, M. D. Oxer, G. Dougan, D. Pickard, D. Slater, N. F. Fairweather. 1992. Use of the nirB promoter to direct the slnble expression of heterologous antigens in Salmonella oral vaccine strains: development of a single-dose oral tetanus vaccine. Bio/Technology 10: 888-892.

Chow M., R. Yabrov, J. Bittle, J. Hogle, D. Baltimore. 1985. Synthetic peptides from four separate regions of the poliovirus type 1 capsid protein VP1 induce neutralizing antibodies. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 910-914.

Clarke B. E., S. E. Newton, A. R, Carroll, M. J. Francis, G. Appleyard, A. D. Syred, P. E. Highfield, D. J. Rowlands, F. Brown. 1987. Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis В core protein. Nature 330: 381-384.

Cohen J. 1993. Naked DNA points way to vaccines. Science 259: 1691-1692.

Cremer К. J., M. Macketl, С. Wohlenberg, A. L. Notkins, B. Moss. 1985. Vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glycoprotein D prevents latent herpes in mice. Science. 228: 737-740.

DiMarchi R., G. Brooke, C. Gale, V. Cracknel), T. Doel, N. Mowat. 1986. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide. Science 232: 639-641.

Ferguson M. 1991. Progress towards rabies control. Trends Biotechnol. 9: 7—11.

Finkelstein A., R. F. Silva. 1989. Live recombinant vaccines for poultry. Trends Biotechnol. 7: 273-277.

Flexner C., A. Hugin, B. Moss. 1987. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression. Nature 330: 759 262

Вакцины 245

Graham F. L. 1990. Adenoviruses as expression vector and recombinant vaccines. Trends Biotechnoi. 8: 85-87.

Horwitz M. A., B.-W. E. Lee, B. J. Dillon, G. Harth, 1995. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1530-1534.

Jones T. R., S. L. Hoffman. 1994. Malaria) vaccine development. Clin. Microbioi. Rev. 7: 303—310.

Kaper J. B., H. Lockman, M. M. Baldini, M. M. Levine. 1984. A recombinant live oral choiera vaccine. Bio/Technology 2: 345-349.

Kaper J. В., H. Lockman, M. M. Baldini, M. M. Levine. 1984. Recombinant nontoxinogenic Vibrio choier-ae strains as attenuated cholera vaccine candidates. Nature 308: 655-658.

Kaper J. В., J. G. Morris, Jr., M. M. Levine. 1995. Choiera. Clin. Microbioi. Rev. 8: 48-86.

Kaslow D. C., S. N. Isaacs L A. Quakyi, R. W. Gwadz, B, Moss, D. B. Keister. 1991. Induction of Plasmodium falciparum transmission-blocking antibodies by recombinant vaccinia virus. Science 252: 1310-1313.

Кupper H., W. Keller, С. Kurz, S. Forss, H. Schauer, R. Franze, K. Strohmaier, O. Marquardt, V. G. Zaslavsky, P. H. Hofschneidtr. 1981. Cloning of cDNA of major antigen of fool and mouth disease virus and expression in E. colt. Nature 289: 555-559.

Lasky L. A., D. Dowbenko, C. C. Simonsen, P. W. Berman. 1984. Protection of mice from lethal herpes simplex virus infection by vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein D. Bio/Technology 2: 527-532.

Lowe R. S., P. M. Keller, B..!. Ketch, A. J. Uavison, Y. Whang, A. J. Morgan, E. KicfT, R. W. Elfe. 1987. Varicella-zoster virus as a live vector for the expression of foreign genes, Proc. Natl. Acad. ScL USA 84: 3896-3900.

Mekalanos J. J., J. C. Sadoff. 1994. Cholera vaccines: fighting an ancient scourge. Science 265: 1387-1389.

Michel M.-L., H. L. Davis, M. Schleef, M. Mancini, P. Tiollais, R. G. Whalen. 1995. DNA-mediated immunization to the hepatitis В surface antigen in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis В viral infection in humans. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 5307-5311.

Miner J. N., D. E. Hruby. 1990. Vaccinia virus: a versatile tool for molecular biologists. Trends Biotechnoi 8: 20-25.

Moss B. 1991- Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development, Science252: 1662—1667.

Nabel G. J., P. L· Feigner. 1993. Direct gene transfer for immunotherapy and immunization. Tnends Biotechnoi. 11:211-215.

Newton S. M. C., C. O. Jacob, B. A. U. Stocker. 1989. Immunoresponse to cholera toxin upitope inserted in Salmonella flagellin. Science 244: 70-72.

Nussenzweig R. S., C. A. Long. 1994. Malaria vaccines: multiple targets. Science 265: 1381—1383.

Oehen S., H. Hengartner, R. M. Zinkernagel. 1991. Vaccination for disease. Science 251: 195-197.

Paoletti E., J. TarlagHa January 1995. Interferon sensitive recombinant poxvirus vaccine. U.S. patent 5, 378,457.

Ratafia M. 1987. Worldwide opportunities in genetically engineered vaccines. Bio/Technology 5: N54-1158.

Sizemore D, R., A. A. Branstrom, J. C. Sadoff. 1995, Attenuated Shigella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Science 270: 299-302.

Stover C. K., V. F. de la Cruz, T. R. Fuerst, J. E. Buriein, L· A. Benson, L.T Bennett, G. P. Bansal, J. F. Young, M. H. Lee, G. F. Hatfull, S. B. Snapper, R. G. Barletta, W. R. Jacobs, Jr., B. R. Bloom. 1991. New use of BCG for recombinant vaccines. Nature 351: 456—460.

Tang D.-C-, M. DeVit, S. A. Johnston. 1992. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152-154.

Tartaglia J., E. Paoletti. 1988. Recombinant vaccinia virus vaccines. Trends Biotechnoi. 6: 43-46.

Titus R. G_M J. G. Gueiros-Filtio, L. A. R. De Freitas, S. M. Beverly. 1995. Development of a safe live Leishmania vaccine line by gene replacement. Proc. Natl. Acad. Sei. USA92: 10267-10271.

Uhner J. В., J. J. Donnelly, S. Parker, G. II. Rhodes, P. L. Feigner, V. J. Dwarki, S. H. Gromkowski, R. R. Deck, C. M, DeWïtt, A. Friedman, L. A. I lawe, K. R. Leander, D. Martine/, H. C. Perry, J. W. Shiver, D. I,. Montgomery, M. A. Liu. 1993.

246 ГЛАВА 11

Heterologous protection against influenza by injection of DN A encoding a viral protein. Science 259: 1745-1749.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Опишите вкратце способ создания вакцины против бактерий, продуцирующих токсин.

2. Что ограничивает применение традиционных вакцин?

3. Предположим, что вы принимаете участие в работе международной организации по охране здоровья животных и вам нужно создать вакцину против крайне вирулентного вируса крупного рогатого скота. Известно, что геном представляет собой полиаденилированную линейную одноцепочечную РНК длиной 10 т. п. н. и содержит восемь разных генов. Вирус не имеет оболочки, его основной антигенной детерминантой является белок капсида (VP 2). Какую стратегию вы используете?

4. Какие подходы применяются при создании пептидных противовирусных вакцин?

5. Что представляет собой вирус коровьей оспы и как с его помощью можно получать уникальные живые рекомбинантные вакцины?

6. Предположим, что вы выделили РНК-содержащий вирус, вызывающий бешенство у скунсов и енотов. Как на основе этого очищенного вируса создать рекомбинантную вакцину, защищающую животных от бешенства?

7. Как работник Всемирной организации здравоохранения вы должны найти оптимальный способ искоренения бешенства в популяциях диких животных. Предположим, что у вас есть пептидная вакцина и вакцина на основе вируса коровьей оспы; выберите одну из них и обоснуйте ваше решение.

8. Как можно использовать в качестве вакцины бактерии со жгутиками?

9. Перечислите преимущества живой рекомбинантной вирусной вакцины перед неживой и субъединичной вакцинами.

10. Опишите несколько подходов, использованных при создании холерной вакцины.