Конструирование генов

Конструирование комбинативных генетических структур, де­терминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух мето­дов - выделении (вырезании) генов и их синтезе.

Выделение генов. Гены выделяют из геномов про- и эукариот, вирионных геномов и плазмид, содержащих от 3-4 (F-плазмиды, фактор бактериоциногенности) до 15-20 генов (R-плазмиды), способных интегрироваться с клеточным гено­мом и передаваться реципиентным клеткам благодаря наличию пилей (половых ворсинок) и tra-оперонов (англ. transfer - пере­нос). При этом используются особые ферменты рестриктазы (лат. restrictio - разрыв), или эндодезоксирибонуклеазы, рассе­кающие молекулу ДНК на отдельные сегменты с липкими кон­цами, к которым легко присоединяются другие рестриктазные фрагменты.

Первые рестриктазы получил Г. Смит, а применил их как «молекулярные ножницы» для получения генов и составления генных карт Д. Натане, за что они совместно с В. Арбером, от­крывшим механизм рестрикции, были удостоены в 1978 г. Но­белевской премии.

В настоящее время генные инженеры располагают сотнями рестриктаз. Каждая из них расщепляет ДНК независимо от ее происхождения по строго определенным сайтам (участкам) узна­вания нуклеотидных последовательностей. Величина получае­мых при этом фрагментов ДНК зависит от частоты встречаемо­сти сайтов узнавания в молекуле ДНК и ее длины. Так, если сайт узнавания составляет 4 пары нуклеотидов (пн), то он обычно по­вторяется через 256 пн, при длине 5 пн - через 1024, 6 пн - че­рез 4 096 пн, 7 пн - через 16 384 пн, 8 пн - через 65 536 пн. С учетом этого для получения фрагментов ДНК, по величине со­измеримых с генами, естественно, выбирают рестриктазы с ред­ко встречаемыми сайтами узнавания нуклеотидных последова­тельностей. Такой рестриктазой, в частности, является EcoRl, образование которой детерминируется в кишечной палочке плазмидой R1. Специфически распознаваемые ею нуклеотидные последовательности встречаются в молекулах ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пн. Следовательно, фрагмент ДНК, образую­щийся под действием EcoRl, может включать два и более генов (1 ген в среднем содержит 1000-1500 пн).

Полученные гены, однако, не всегда соответствуют функ­ционирующим ввиду того, что сайты расщепления рестриктаз в исходных молекулах ДНК оказываются в их пределах. Это при­водит к дроблению структурных генов или утрате ими регуля-торных последовательностей. В подобных случаях выделенные гены подключают к промоторам или же прибегают к процедуре наращивания недостающих нуклеотидов. Плохо функциони­рующий ген активируют дополнительными вставками аналогич­ных ему генов, что называют тандемной амплификацией (англ. tandem - один за другим, лат. amplificatio - увеличение), а к ге­нам со сдвигом рамки считывания информации добавляют лин­керы (англ. link - связующее звено), чтобы подстроить их под рамку считывания предшествующего гена или его фрагмента.

Успешное использование выделенного гена определяет пре­жде всего реципиентная клетка. Так, гены эукариот, в составе которых, как известно, имеются не содержащие информации интроны, не экспрессируются в клетках прокариот, так как в них не происходят процессинг и сплайсинг и к тому же недеятельными оказываются промоторы. Напротив, экспрессия генов прокариот в бактериях достигается без особых трудностей.

Синтез генов. Таким образом, выделить функционирующие гены рестриктазным дроблением генного материала микробов, клеток животного и растительного происхождения очень труд­но, а получить их из геномов РНК-содержащих вирусов вообще невозможно.

Поэтому для получения генов эукариот и РНК-вирусов был разработан метод синтеза ДНК-копий (транскриптов) на матри­цах клеточной иРНК и вирионной РНК с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы. При этом обратную транскриптазу получают из ретровирусов, в частности вирионов птичьего миелобластоза, саркомы Рауса, мышиной лейкемии, и с ее помощью поэтапно катализируют на РНК синтез одной, а затем и другой нити ДНК. Полученные та­ким искусственным путем ДНК-транскрипты на иРНК клеток часто тоже не имеют регуляторных нуклеотидных последова­тельностей, ибо уже изначально просто не воспроизводятся при их транскрипции. Иначе обстоит дело с вириоными РНК. Синте­зированные на них ДНК-транскрипты полностью комплементарны РНК-генам и кодируют аналогичные им генные продукты.