Методы гибридизации соматических клеток

Соматические клетки содержат весь объем генетической информации. Это дает возможность изучать многие вопросы генетики человека, которые невозможно исследовать на целом организме. Благодаря методам генетики соматических клеток человек как бы стал одним из экспериментальных объектов. Чаще всего используют клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови. культивирование клеток вне организма позволяет получить достаточное количество материала для исследования. что не всегда возможно взять у человека без ущерба для здоровья.

В 1960 г. французский биолог Ж. Барский, выращивая вне организма в культуре ткани клетки двух линий мышей, обнаружил, что некоторые клетки по своим морфологическим и биохимическим признакам были промежуточными между исходными родительскими клетками. Эти клетки оказались гибридными. Такое спонтанное слияние клеток в культуре ткани происходит довольно редко. В дальнейшем оказалось, что частота гибридизации соматических клеток повышается при введении в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, который как вообще все вирусы, изменяет свойства клеточных мембран и делает возможным слияние клеток. Под влиянием такого вируса в смешанной культуре двух типов клеток образуются клетки, содержащие в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток – гетерокарионы. После митоза и последующего разделения цитоплазмы из двуядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион – настоящую гибридную клетку, имеющую хромосомы обеих родительских клеток.

Обычно для гибридизации с клетками человека применяют соматические клетки грызунов, чаще всего мыши. Для того чтобы облегчить слияние клеток разных видов, в культуральную среду добавляют вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетовым облучением, или полиэтиленгликоль. Для отбора слившихся клеток от исходных клеток человека и мыши клетки выращивают на специальной селективной среде, которая позволяет размножаться только гибридным клеткам (для этого в опытах по слиянию использовали линии клеток мышей с недостаточностью по некоторым ферментам, чаще всего с недостаточностью по тимидинкиназе). В только что образовавшихся гибридных клетках ядра содержат оба набора хромосом человека и мыши. Однако последующее размножение гибридных клеток приводит к постепенной утрате хромосом человека у гибридов, поэтому в результате остается только одна или даже фрагмент одной из хромосом человека. Когда метод гибридизации соматических клеток был только создан, то тестировалось присутствие в гибридных клетках, в которых осталась одна или несколько хромосом человека, ферментов и других белков человека, которые по своим характеристикам отличались от соответствующих белков мыши, или клетки мыши были дефицитны по каким-то ферментам. Обычно из гибридов соматических клеток создавали панели, в которых присутствовали хромосомы человека в минимальных количествах и в самых разных комбинациях. Поэтому для установления локализации гена соответствующего фермента или другого белка человека не было необходимости применять только те гибриды соматических клеток, которые содержали лишь одну хромосому человека. Вместе с тем сначала можно было картировать только гены человека, проявляющиеся на клеточном уровне, и невозможно было работать с генами, имевшими сложное феноти-пическое проявление, при котором первичный дефект оставался неизвестным. Методы молекулярной генетики позволили решить эту проблему, и в настоящее время с помощью ПЦР, блоттинга по Саузерну и иных молекулярно-генетиче-ских методов можно тестировать гибридные соматические клетки на наличие в оставшихся хромосомах человека любых генов независимо от того, известен ли продукт этих генов или нет. Недостатком метода картирования генов человека с помощью гибридных соматических клеток было то, что часто локализация генов устанавливалась с точностью до хромосомы. Разрешающие возможности в картировании генов таким путем были, следовательно, ограничены. Однако если в гибридных клетках осталась только одна хромосома человека, то, облучив такие гибридные клетки рентгеновскими или гамма-лучами, можно добиться фрагментации этой хромосомы и после получения новых гибридных клеток с помощью дополнительного слияния с клетками грызунов (после облучения гибридные клетки без дополнительного слияния с клетками грызунов погибают) уточнить локализацию интересующего исследователей генов вплоть до небольшого фрагмента определенной хромосомы (картирование с помощью радиационных гибридов). Особенностью радиационных гибридов является то, что образующиеся после облучения фрагменты хромосомы человека не способны проходить митоз и теряются, если они не сливаются с хромосомами мыши. Эти фрагменты человеческих хромосом могут быть столь небольшими по размеру, что уже не обнаруживаются цитологически. Поэтому до проведения опытов по картированию необходимо специальными методами, в частности с использованием ДНК-полиморфных маркеров (обычно применяют Alu-полиморфизм, отсутствующий у мыши), уточнить, какие фрагменты определенной хромосомы человека сохранились в радиационных гибридах. Еще одной особенностью радиационных гибридов является то, что на них можно изучать сцепление между генами во фрагментах хромосом человека и даже оценивать генетическое расстояние между сцепленными локусами, исходя из того, насколько часто они присутствуют во фрагментах вместе или раздельно. При этом предполагают, что чем ближе расположены гены друг к другу на хромосоме, тем реже радиационно индуцированные разрывы в хромосоме будут разделять сцепленные гены.

10. Количественная и качественная специфика проявления генов в признаках: пенетрантность, экспрессивность, плейотропность, генокопии и фенокопии мутаций.

Широту генных взаимодействий необходимо учитывать при анализе генетических явлений. Показателем зависимости функционирования наследственных задатков от характеристик генотипа служит экспрессивность и пенетрантность генов. Экспрессивность заключается в изменчивости количественного выражения признака у разных особей – носителей соответствующего аллеля.

Из рис. 38 видно, что большинство организмов-носителей имеет среднюю степень развития признака. В направлении меньших больших и значений относительное число особей снижается.

Под пенетрантностью понимают способность гена обеспечить развития признака до такой степени, когда его удается обнаружить с помощью имеющихся методов обследования. Пенетрантность измеряется процентом организмов, имеющих в фенотипе признак, от общего количества обследованных носителей соответствующего аллеля. Экспрессивность и пенетрантность отражают зависимость функции гена от особенностей генотипа и проявляются в процессе развития признака. Следовательно, в основе этих генетических явлений может лежать колебание активности самих генов, характер взаимодействий продуктов генной активности, особое сочетание условий среды в онтогенезе человека.

Зависимость нескольких признаков от одного гена получила название плейотропности. Это явление было обнаружено еще Менделем, заметившим, что у растений гороха с красными цветками стебли всегда темнее, чем у особей с белыми цветками.

Генокопии – случаи, когда одно и то же состояние признака развивается под контролем разных генов. Так, фенилкетанурия возникает при дефиците синтеза нескольких ферментов.

Сходные состояния некоторых признаков возникают у одних особей благодаря наличию в генотипе определенного аллеля, а у других – результате особого сочетания внешних факторов. Изменения фенотипа, сходные с изменениями генетической природы, но вызванные факторами внешней среды, называют фенокопиями. Так, у женщин, перенесших на ранних сроках беременности краснуху, нередко рождаются дети с врожденной катарактой (помутнение хрусталика), не отличимой от наследственной катаракты.

15. Классификация форм изменчивости, их значение в онтогенезе и эволюции.

Генетика изучает не только явления наследственности, но и изменчивости организмов. И з м е н ч и в о с т ь - это свойство живого изменяться, выражающееся в способности приобретать новые признаки или утрачивать прежние. Причинами изменчивости являются разнообразие генотипов, условия среды, которые определяют разнообразие в проявлении признаков у организмов с одинаковыми генотипами.

┌───────── ИЗМЕНЧИВОСТЬ────────┐

Фенотипическая Генотипическая

1.Онтогенетическая 1. Комбинативная

2.Модификационная 2. Мутационная

Формирование различных типов изменчивости является следствием взаимодействия внешней среды, генотипа и фенотипа

Анализируя изменчивость любого организма, можно убедиться в том, что многие различия между особями находятся в зависимости от условий окружающей среды. При идентичном генотипе две особи могут быть фенотипически несхожими, если развивались в разных условиях среды. Такие фенотипические различия, вызываемые внешними факторами, называются м о д и ф и к а ц и о н н ы м и.

Выяснить соотносительную роль и характер взаимодействия генотипа и среды в становлении фенотипа особи можно только исследовав модификации, возникающие под воздействием различных факторов среды. Знание характера модификаций и причин, их вызывающих, необходимо для понимания закономерностей эволюции, т.к. естественный отбор оперирует как с мутациями, их комбинациями, так и с модификациями. Модификации имеют большое значение в понимании медицинских аспектов воспитания здорового гармонически развитого человека.

Модификационная изменчивость - фенотипические различия, возникающие в следствие воздействия факторов внешней среды.

Онтогенетическая изменчивость - это постоянная смена признаков в процессе развития особи (онтогенез земноводных, насекомых, развитие морфофизиологических и психических признаков у человека).

Модификационная изменчивость детерминируется генотипом. Модификации бывают с е з о н н ы е, э к о л о г и ч е с к и е.

Сезонные модификации - генетически детерминированная смена признаков в результате сезонных изменений климатических условий.

Экологические модификации - адаптивные изменения фенотипа в ответ на изменение условий внешней среды. Фенотипически они проявляются в степени выраженности признака. Экологические модификации затрагивают количественные (масса животных, потомство) и качественные (цвет кожи у человека под влиянием УФ-лучей) признаки.

Приспособительный (адаптивный) характер имеют все наиболее распространенные модификации. Так повышение числа эритроцитов и содержание Hb в крови животных и человека в горах представляют приспособление для лучшего использования кислорода. Загар кожи - приспособление воздействия чрезмерной инсоляции. Установлено, что адаптивными бывают только те модификации, которые вызываются обычными изменениями природных условий. Не имеет приспособительного значения модификации, вызываемые различными химическими и физическими факторами. Так, воздействуя повышенной температурой на куколки дрозофилы, можно получить особи с закрученными крыльями, с вырезками на них, что напоминает мутации.

Экологические модификации обратимы и со сменой поколений при условии изменения внешней среды могут не проявляться (колебания удоев молока, смена количества эритроцитов и лейкоцитов при заболеваниях или изменениях условий обитания). Если в ряду поколений условия не меняются, то степень выраженности признака в потомстве сохраняется. Такие модификации называются длительными. При изменении условий развития длительные модификации не наследуются. Ошибочно мнение, что воспитанием и внешним воздействием можно закрепить в потомстве новый признак (пример дрессировки собак).

Модификации носят адекватный характер, т.е. степень выраженности признака находится в прямой зависимости от вида и продолжительности действия фактора. Так, улучшение условий содержания скота вызывает увеличение массы животных.

Одним из основных свойств модификаций является их массовость - один и тот же фактор вызывает одинаковое изменение особей, сходных генотипически. Предел и степень выраженности модификаций контролируется генотипом (пример с однояйцовыми близнецами).

Модификации обладают разной степенью стойкости. Так, загар у человека проходит по окончании действия инсоляции. Другие модификации, возникшие на ранних стадиях развития могут сохраняться в течение всей жизни (кривоногость после рахита).

Модификации не передаются по наследству. Модификации однозначны для самых примитивных и высокоорганизованных организмов. К числу таких модификаций относятся фенотипические изменения, связанные с питанием. Изменение не только количества, но и качества пищи могут обусловит возникновение модификаций (авитаминозы человека, дистрофия). К наиболее частым модификациям млекопитающих и человека относятся фенотипические изменения, вызываемые физическими нагрузками (увеличение объема мышц в результате тренировки, усиление кровоснабжения, обратные изменения при малоподвижном образе жизни).

Вариации в проявлении гена не являются беспредельными. Они ограничиваются нормой реакции организма. Н о р м а р е а к ц и и - это предел модификационной изменчивости признака. Наследуется норма реакции, а не сами модификации, т.е. способность к развитию признака, а форма его проявления зависит от условий окружающей среды. Норма реакции - конкретная количественная и качественная характеристика генотипа. Различают признаки с широкой нормой реакции (масса скота, урожайность с/х культур), узкой (процент жирности молока, содержание белков в крови у человека) и однозначной нормой (большинство качественных признаков - цвет волос, глаз). Под влиянием некоторых вредных факторов, с которыми человек не сталкивается в процессе эволюции, возможности модификационной изменчивости, определяющей нормы реакции исключаются. Возникают уродства или аномалии, которые называются м о р ф о з а м и (изменения морфологических, биохимических, физиологических признаков у млекопитающих: 4 сердца, один глаз, две головы; у человека - рождение детей без конечности, непроходимость кишечника, опухоль верхней губы вследствие принятия препарата талидомида [1961]). К таким же тератогенам относятся: хинин, галлюциноген ЛСД, наркотики, алкоголь. Морфоз - резко изменяет новый признак в отличие от модификаций, вызывающих изменение степени выраженности признака. Морфозы возникают в критические периоды онтогенеза и не носят приспособительного характера. Фенотипически морфозы сходны с мутациями и в таких случаях они называются ф е н о к о п и я м и. Механизмом фенокопий является нарушение реализации наследственной информации. Они возникают вследствие подавления функции определенных генов. По своему проявлению они напоминают функцию известных генов, но не наследуются.

Генотипическая изменчивость

Мутационная изменчивость - это такой тип изменчивости, при которой происходит скачкообразное, прерывистое изменение наследственного признака. Поэтому, м у т а ц и и - это внезапно возникающие стойкие изменения генетического аппарата, включающие как переход генов из одного аллельного состояния в другое, так и различные изменения числа и строения хромосом, генетических структур цитоплазмы.

На основании изучения наследственной изменчивости внутри популяций одного вида и при сравнении популяций разных видов Н. И. Вавилов сформулировал з а к о н г о м о л о г и ч н ы х р я д о в наследственной изменчивости: Виды и роды, генетически близкие, характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости с такой правильностью, что, зная ряд форм в пределах одного вида, можно предвидеть нахождение параллельных форм у других видов и родов. Чем ближе расположены генетически в общей системы роды и линеоны, тем полнее сходство в рядах их изменчивости. Целые семейства растений в общем характеризуются определенным циклом изменчивости, проходящим через все роды и виды, составляющие семейство. Главное в законе гомологичных рядов состояло в новом подходе к пониманию принципов мутаций в природе. Оказалось, что процесс наследственной изменчивости программирован со стороны его исторически сложившегося генотипа. Мутации являются случайными, если их брать по отдельности. Однако, в целом, они в свете закона гомологичных рядов становятся в системе вида закономерным явлением.

Мутации, идущие как бы случайно в разных направлениях, при их объединении обнаруживают общий закон.

Термин мутация впервые был предложен де Фризом в его труде "Мутационная теория" (1901-1903). Основные положения этой теории:

- мутация возникает внезапно, новые формы вполне устойчивы;

- мутации являются качественными изменениями;

- мутации могут быть полезными и вредными;

- одни и те же мутации могут возникать повторно.

20. Способы репарации генетического материала. Мутации, связанные с нарушением репарации и их роль в патологии человека.

Важное значение для ограничения неблагоприятных последствий генных мутаций имеют естественные антимутационные барьеры. Одним из них является парность хромосом в диплоидных наборах хромосом эука-риот, которая препятствует проявлению рецессивных мутаций у гетерозиготных особей. Главным антимутационным барьером рассматривается выработавшая в процессе эволюции способность к репарации наследственного материала. Её сущность - в устранении из наследственного материала клетки изменённого участка.,

Различают 3 системы репарации генетического материала: эксци-зионная репарация (репарация путём «вырезания»), фоторепарация и пострепликативная репарация.

Механизм эксцизионной репарации заключается в ферментативном разрушении изменённого участка молекулы ДНК с последующим восстановлением на этом отрезке нормальной последовательности нуклеотидов. Такой механизм включает следующие этапы (рис. 81): а) разрыв спирали ДНК у места повреждения при участии эндонуклеаз; б) удаление поврежденного участка с запасом в обе стороны с помощью эндонуклеаз; в) синтез при участии ДНК-полимеразы на месте дефекта нормального участка ДНК; г) «сшивание» последнего с образовавав-шимися концами спирали ДНК при помощи фермента ДНК-лигазы (восстановление непрерывности ДНК).

Например, под действием УФ-лучей у человека нарушается комплементар-ность пар нуклеотидов в двойной спирали ДНК (появляются пары Т-Т, Ц-Ц и т.п.). Они устраняются вышеописанным способом. Однако у различных индивидуумов наблюдаются генетические различия в активности репаративньгх ферментов и надёжности функционирования механизма ферментативного разрушения изменённого участка молекулы ДНК в целом. У ряда людей наблюдается изменение ДНК и, как следствие, возникновение заболевания «пигментная ксеродерма». В клетках эукариот обнаружены два вида репарации «путём вырезания»: 1) более продолжительная репарация (длительность процесса - от 1 до 24 часов), восстанавливающая большой фрагмент ДНК (около 100 нуклеотидов); 2) быстродействующая репарация (продолжается от 5 минут до 2 часов), восстанавливающая 3-4 нуклеотида.

Пострепликативная репарация «включается» тогда, когда эксци-зионная репарация «не справляется» с устранением всех повреждений, возникших в ДНК до её репликации. При репликации во второй спирали ДНК возникают бреши - однонитевые пробелы, соответствующие изменённым нуклеотидам первой спирали. Бреши заполняются участками цепи с нормальной последовательностью нуклеотидов уже в ходе пострешгикативной репарации при участии ДНК-полимеразы.

Фоторепарация заключается в расщеплении ферментом (дезоксирибо-пиримидинфотолиазой), активируемым видимым светом, циклобутановых димеров, возникающих в ДНК под действием ультрафиолетового излучения.

Механизмам репарации свойственны нарушения и «сбои», которые приводят к повышению чистоты мутаций. Известны специфические мутации, блокирующие механизмы репарации и вызывающие наследственные заболевания (пигментная ксеродерма и др.).

Биологическое значение репарации ДНК заключается в резком снижении частоты мутаций, большинство которых оказываются летальными и полулетальными или же снижающими жизнеспособность организмов, вызывающими аномалии и обусловливающими тератогенез. Благодаря репарации ДНК повышается устойчивость генотипа организма к повреждающим агентам (мутагенам).

Спонтанные повреждения ДНК встречаются довольно часто, такие события имеют место в каждой клетке. Для устранения последствий подобных повреждений имеется специальные репарационные механизмы (например, ошибочный участок ДНК вырезается и на этом месте восстанавливается исходный). Мутации возникают лишь тогда, когда репарационный механизм по каким-то причинам не работает или не справляется с устранением повреждений. Мутации, возникающие в генах, кодирующих белки, ответственные за репарацию, могут приводить к многократному повышению (мутаторный эффект) или понижению (антимутаторный эффект) частоты мутирования других генов. Так, мутации генов многих ферментов системы эксцизионной репарации приводят к резкому повышению частоты соматических мутаций у человека, а это, в свою очередь, приводит к развитию пигментной ксеродермы и злокачественных опухолей покровов. Мутации могут появляться не только при репликации, но и при репарации — эксцизионной репарации или при пострепликативной.

III. Вопросы к коллоквиуму по «БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАРАЗИТИЗМА. РАСПРОСТРАНЕНИЕ

ПАРАЗИТИЧЕСКИХ ФОРМ В ЖИВОТНОМ МИРЕ, протистология и гельминтология».