Постановка ПЦР

Так как объем одной пробы в ПЦР составляет от 10 до 100 мкл, удобно предварительно смешать в одной пробирке все компоненты реакционной смеси, за исключением анализируемого генетического материала и минерального масла. В следующей таблице представлена схема расчета постановки ПЦР объемом 25мкл для амплификации фрагмента гена pY(D17S30):

Компоненты	исходная концентрация	необходимая концентрация в пробе	количество мкл на 1 пробу объемом 25 мкл	количество мкл на 5 проб	количество мкл на 10 проб
1. Н2О			11.8
2. dNTP	2.0 мМ	0.2 мМ	2.5	12.5
3. MgCl2	40 мМ	1.6 мМ	1.0
4. 5Хбуфер	5Х	IX	5.0
5. Taq	5 ед/мкл	1ед	0.2
6. праймеры	5 мкМ	0.5 мкМ	2.5	12.5
7. ДНК				добавляется в каждую пробирку индивидуальный образец по 2 мкл

Праймеры для амплификации участка гена pY(D17S30): 5 '-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3' 5 '-С ACAGTCTTTATTTCTTCAGCG-3'

1. Рассчитать состав реакционной смеси на количество анализируемых
проб + две пробы для отрицательного и положительного контролей + 1
проба, учитывающая возможную неточность автоматических пипеток.

2. Пронумеровать одноразовые пробирки для ПЦР (объемом на 0.2 или
0.5 мл). Количество пробирок соответствует числу анализируемых проб
+ две пробирки для отрицательного и положительного контролей.

3. Внести в пробирку компоненты реакционной смеси в следующей
последовательности: деионизованная вода, dNTP, MgCl₂, 5Хбуфер,
Taq-полимераза. При переходе от одного компонента к другому
обязательно менять наконечники. Тщательно перемешать
пипетированием, избегая вспенивания и образования аэрозолей.
Добавить праймеры и еще раз осторожно перемешать содержимое
пробирки.

4. Приготовленную реакционную смесь разлить по 23 мкл в
пронумерованные пробирки для ПЦР.

5. В отрицательный контроль добавить 2 мкл дистиллированной воды.

6. В анализируемые пробы добавить по 2 мкл анализируемых образцов
генетического материала, перемешать наконечником. При переходе от
одной пробирке к другой обязательно менять наконечник.

7. Добавить по 1 капле минерального масла (объемом 30-40 мкл), масло
осторожно наносится на стенку пробирки, при этом наконечник не
должен касаться стенки пробирки. Тщательно закрыть пробирки.

8. В положительный контроль под слой масла добавить образец
контрольной ДНК, сбросить наконечник.

9. Поставить пробирки в амплификатор.

Ю.Включить выбранную программу амплификации. При использовании модифицированной ДНК-полимеразы на первом этапе необходимо прогреть пробы 3 мин при 94 "С для активации полимеразы, затем запустить программу. Например, для амплификации участка гена pY используется следующий температурный режим: 94 °С - 1 мин; 51 °С -1.5 мин; 72 °С - 2 мин, количество циклов - 35.

ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Смесь амплифицированных фрагментов ДНК, образовавшуюся в результате ПЦР анализируют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Выбор метода электрофореза определяется следующими обстоятельствами: ПААГ обладает большей разрешающей способностью, чем агарозный, поэтому ПААГ предпочтительнее использовать при исследовании локусов, в которых близкие аллельные варианты имеют лишь незначительную разницу в длине последовательностей. Например, соседние аллели локуса АроВ отличаются друг от друга только на 16 нуклеотидов и поэтому результат их разделения в агарозном геле буде нечетким, в этом случае предпочтительнее использовать ПААГ. В то же время аллели локуса D1S80 отличаются друг от друга на 70 нуклеотидов и поэтому могут быть легко дифференцированы в агарозном геле. Теоретически целесообразно при типировании любого локуса начинать с пробного электрофоретического разделения в агарозном геле. Результаты его позволяют сориентироваться и определиться в необходимости проведения более сложного и трудоемкого электрофореза в ПААГ. Пробный электрофорез предназначен прежде всего для того, чтобы удостовериться, что в исследуемых объектах выявляются амплифицированные фрагменты и что данная ПЦР-система работает специфично. Результат реакции может позволить сделать вывод и без дополнительного исследования с

помощью ПААГ. При необходимости лучшего разделения амшшфикатов для уточнения результатов следует дополнить исследование гель-электрофорезом в ПААГ с последующим окрашиванием бромистым этидием или серебром. В том случае если ПЦР проводится с диагностической целью для исследования наличия или отсутствия чужеродного генетического материала, то проводится электрофорез в 2%-агарозном геле. По окончании электрофореза можно судить о присутствии в анализируемом образце исследуемой ДНК.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ

• Подготовить 2% агарозный гель в IX трис-боратном буфере (пропись
10Х трис-боратного буфера приведена на стр.25-26); в расплавленный
раствор агарозы перед заливкой в камеру добавить бромистый этидий до
конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Толщина геля должна составлять 2.5-
3 мм. После того, как агароза застынет, залить в камеру электрофорезный
буфер с бромистым этидием, удалить гребенку, установить электроды.

• По окончании амплификации перенести ПЦР-пробирки в комнату для
детекции образцов. Внести в лунки геля по 10 мкл амплификатов,
провести электрофорез при напряженности поля ЮВ/см в течение 1-2
часов, в зависимости от размера амплификатов. Пробирки с остатками
амплификатов можно хранить при -20°С в морозильной камере,
расположенной в этой же комнате.

• Перенести гель на трансиллюминатор и идентифицировать
образовавшиеся продукты амплификации относительно положительного
контроля или используя продукты рестрикции pBR322 или pUC. При
работе с трансиллюминатором нужно всегда использовать защитный
экран, так как ультрафиолет вызывает ожог глазной роговицы.

• В случае необходимости гель можно сфотографировать на пленку
"Микрат-300", используя оранжевый светофильтр, время выдержки
зависит от интенсивности свечения, мощности трансиллюминатора,
подбирается экспериментально и находится в пределах 2-10 минут.

• Перенести гель в закрывающейся контейнер для последующего
уничтожения.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Существует большое количество методик электрофореза в ПААГ. Основным требованием к выбранному методу является достаточное разрешение, что достигается соответствующей разгонкой. Разгонка должна быть такой, чтобы обеспечивать четкую дифференциацию двух соседних аллелей. Для локуса D1S80 рекомендуется использовать гель длиной не менее 32 см. Физические параметры электрофореза -напряжение, ток, продолжительность зависят от размеров электрофоретической камеры, ее конструкции, наличия или отсутствия системы охлаждения и т.д. При выборе величины тока следует учитывать, что при слишком медленном движении фрагментов по гелю может быть весьма ощутим эффект диффузии, что приводит к отсутствию четкости сигнала или даже к исчезновению его по мере прохождения ДНК по гелю. В то же время, слишком большой ток, обеспечивая достаточную скорость движения фрагментов ДНК, вызывает перегревание геля, что может ухудшить результат разделения. Поэтому необходимо выбрать те параметры, которые позволяя проводить разгонку максимально быстро, не оказывают неблагоприятного воздействия на ДНК.

СОСТАВ СМЕСИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПААГ

компоненты	6% ПААГ 14см х 24см х 0.75 мм	7% ПААГ 14см х 24см х 0.75мм	8% ПААГ 14см х 24см х 0.75мм	8% ПААГ 21см х 40см х 0.75мм
30% акриламид	7.5 мл	8.75 мл	10.0 мл	18.7 мл
20% глицерин	13.12 мл	13.12 мл	13.12 мл	25 мл
10% персульфат аммония	0.375 мл	0.375 мл	0.375 мл	0.7 мл
ТЕМЕД	0.0375 мл	0.0375 мл	0.0375 мл	0.07 мл
10ХТББ	3.75 мл	3.75 мл	3.75 мл	7.0 мл
Деионизован-ная вода	12.72 мл	11.47 мл	10.22мл	18.53 мл
Общий объем	37.5 мл	37.5 мл	37.5 мл	70.0 мл

Для приготовления 30 % акриламида необходимо к 29.1 г акриламида добавить 0.9 г бис-акриламида, довести деионизованной водой до 100 мл, хранить в темной бутыли в холодильнике при 4°С.

10ХТББ - матричный раствор (0.89Мтрис-0.89Мборат-0.025МЭДТА) трис-боратного буфера, для его приготовления 108 г триса, 55 г борной кислоты и 9.3 г №₂ЭДТА растворяют в дистиллированной

воде, проверяют значение рН и если оно отличается от рН 8.0, то используют 40% NaOH, затем доводят объем буфера до 1 литра. Готовый 10ХТББ можно хранить при комнатной температуре; в качестве рабочего раствора используют 1ХТББ. Этот же буфер используется для проведения электрофореза в агарозном геле.

Быстро, но очень тщательно перемешивают смесь компонентов, не допуская вспенивания и выливают в пространство между стеклами, помещают гребенку. В случае малой толщины геля для заливки его между стеклами удобно пользоваться шприцом с толстой иглой. После полной полимеризации геля (60-90 мин), вынимают гребенку, трижды промывают лунки 1ХТББ, устанавливают пластины в электрофоретическую камеру, наливают электродный буфер (1ХТББ). Вносят в лунки по 12-20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК, по обе стороны от исследуемого набора образцов можно внести маркеры с аллелями разного размера. Электрофорез проводят при 250В/50А в течение 4-х часов для разделения аллелей, отличающихся на 50-70 нуклеотидов и при 130В/30А в течение 18 часов при исследовании аллелей, различающихся на 15-20 нуклеотидов.

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ НИТРАТОМ СЕРЕБРА

1. Разбирают камеру для электрофореза, гель переносят в кювету, которую
помещают на качающуюся платформу. Промывают гель
дистиллированной водой.

2. Заливают гель на 10 мин 10%-ным этанолом (смешивают 1 часть 96%
этанола с 9 частями дистиллированной воды), затем спирт сливают.

3. Заливают гель на 6 мин 1%-ной азотной кислотой (добавляют 15 мл
65%азотной кислоты к 985 мл дистиллированной воды), затем кислоту
сливают.

4. Ополаскивают гель дистиллированной водой, затем промывают в воде
при интенсивном встряхивании в течение 5 мин.

5. На 40 мин заливают гель 0.012 М раствора нитрата серебра (растворяют
2 г AgNO3 в дистиллированной воде, объем доводят до 1 литра), затем
раствор сливают. На этом этапе кювета с гелем должна быть закрыта от
света.

6. Дважды по 1 мин при интенсивном встряхивании промывают гель
дистиллированной водой.

7. К 350 мл охлажденного до 4°С 0.28 М Na₂CO₃ (растворяют 29.7 г Na₂CO₃
в воде, объем доводят до 1 литра), добавляют 175 мкл 37%-ного
формальдегида. (Формальдегид окисляется на воздухе, поэтому его
необходимо хранить плотно закрытым. рН концентрированного раствора

должен быть выше 4.0; если рН становится ниже этого значения, необходимо формальдегид заменить.) Таким охлажденным раствором заливают гель и покачивают его до тех пор, пока не будут отчетливо видны окрашенные фрагменты. Можно использовать свежие порции раствора. Затем проявитель сливают.

8. Чтобы остановить проявление, гель помещают на 1 мин в
дистиллированную воду, а затем на 5 мин в 10%-ную уксусную кислоту.

9. Промывают гель в дистиллированной воде в течение как минимум 5
мин.

Окрашенные фрагменты ДНК определяются в геле в виде темно-желтых полос, расположенных на сероватом фоне. После того, как гель окрасился, его помещают на плотную фильтровальную бумагу, фотографируют или сканируют. При необходимости сохранения геля его можно высушить при помоши целлофановой пленки.

МОДИФИКАЦИИ ПЦР

Существуют различные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов.

ПЦР "горячего старта" - "Hot Start PCR". Данный метод заключается в физическом разделении компонентов реакционной смеси таким образом, чтобы реакция начиналась только после проведения в амплификаторе первого этапа денатурации ДНК. Связано это с тем, чтобы избежать неспецифической гибридизации праймеров с исследуемой ДНК, праймеров между собой, что может произойти в момент смешения комопонентов при постановке реакции. Другими словами, "горячий старт" предотвращает отжиг праймеров на самом первом этапе изменения температуры от комнатной до температуры денатурации. Используется три основных приемы:

1. готовится реакционная смесь, содержащая все компоненты за
исключением Taq-полимеразы, разносится по пробиркам, разливается
масло, устанавливается в амплификатор, после первого этапа
денатурации ДНК в пробирки под слой масла вносится Taq-полимераза.

2. В пробирке создается физический барьер из легкоплавкого воска (с
температурой плавления и 45 °С), препятствующий контакту между
собой компонентов реакционной смеси при комнатной температуре. В

момент повышения температуры в амплификаторе воск плавится и не препятствует дальнейшему проведению ПЦР.

3. Использование модифицированной ДНК-полимеразы. Наиболее удачным методом решения проблемы "горячего старта" является использование модифицированной ДНК-полимеразы, не активной при температурах ниже 55 °С.

" Точная" ПЦР- "Touch down" PCR. Суть модификации заключается в том, что первая реакция отжига выполняется при температуре, которая на 15 °С выше, чем вычисленная температура плавления праймеров и затем уменьшается на 1-2 °С после каждого второго цикла до тех пор, пока не будет достигнута температура плавления. Во время градиентного уменьшения температуры отжига, "желательные" (обязательно праймированные) продукты ПЦР накапливаются в противовес "нежелательным" неспецифическим продуктам. На второй фазе "touch down" ПЦР, во время постоянной температуры отжига предпочтительно амплифицируются "желательные" продукты. Хотя накопление и амплификация побочных продуктов данной модификацией метода не исключается, этот вариант ПЦР очень часто применяется как альтернатива метода "горячего старта".

"Гнездовая" ПЦР - "nested" PCR. Применяется в тех случаях, когда количество исследуемой ДНК очень мало, а также для трудно амплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы). ПЦР проводится в два этапа. На первом этапе проводится обычная ПЦР с подобранными высокоспецифичными праймерами, на втором этапе продукт ПЦР - амплифицированную ДНК подвергают вторичной амплификации с использованием второй пары, так называемых, "внутренних" праймеров. Специфичность реакции увеличивается благодаря использованию второй пары праймеров, так как неспецифически амплифицированные продукты первого этапа элиминируются из циклов амплификации на втором этапе.

PCR in situ. Реакцию амплификации можно проводить не только в растворе, но и непосредственно на хромосомных препаратах единственной клетки, полученной в результате микроманипуляций. Данная модификация, в комбинации с nested-праймерами, часто применяется в пренатальной диагностике.

RAPD-PCR. (Random Amplified Polymorohic DNA) - амплификация ДНК со случайными, короткими праймерами, не являющимися

компонентами генов, но распределенные в геноме в районе повторяющихся последовательностей. Полученная в результате картина электрофоретического распределения продуктов ПЦР будет индивидуальна для каждого организма или индивида.

ПЦР длинных фрагментов — Long PCR. Б лагодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований, таких как особый подбор праймеров, использование двух различных ДНК-полимераз одновременно, (одна из которых обладает редактирующей активностью), температурных условий полимеризации, (уменьшением те:мпертуры денатурации до нескольких секунд, что приводило к уменьшению депуринизации ДНК при высоких температурах), применение триц,инового буфера, стало возможным проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих длинной 35 000 пар оснований.

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ В

ЛАБОРАТОРИЯХ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР требует специально оборудованных помещений и тщательного соблюдения техники безопасности во избежании контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, ложно-положительных результатов.

Основными видами контаминации при проведении ПЦР, являются следующие:

• перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки
клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси),
приводящая к появлению ложно-положительных результатов; поэтому
необходимо менять наконечники при переходе от одной пробирки к
другой.

• контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая
наибольшее значение, так как в процессе ПЦР амшгаконы
накапливаются в огромных: количествах, легко переносятся
аэрозольным путем и являются идеальными продуктами для
реамплификации. По некоторым оценкам количество
амплифицированных молекул составляет 6 млрд/мкл и одна капля
аэрозоля может содержать до 24000 копий амплификата. Аэрозоли
могут образовываться при встряхивании пробирок на вортексе,

открывании микроцентрифужных пробирок, работе с микродозаторами и центрифугировании в вакууме. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток, лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов, кожи сотрудников лаборатории приводят к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно, требуются значительные затраты времени и средств. Во всех случаях контролем для ложноположительной реакции является отсутствие положительного сигнала в пробе с заведомо отсутствующей исследуемой ДНК. Отрицательный контрольный образец должен проходить те же стадии обработки, что и клинические образцы.

Ложноотрицательный результат может быть вызван наличием ингибиторов реакции, недостаточной чувствительностью реакции, ошибками при выделении ДНК и др. Поэтому в каждой серии анализов должен присутствовать положительный контроль - образец с заведомым присутствием участка ДНК для данных праймеров.

Лаборатория, где проводится ПЦР требует территориального разделения на три зоны для выполнения отдельных процедур.

• первая зона предназначена для приготовления ПЦР-реактивов;

• во второй зоне проводится выделение ДНК из клинических образцов и
постановка ПЦР;

В первой и второй зонах запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

• третья зона предназначена для детекции продуктов амплификации;

В третьей зоне допускается использовать другие методы детекции генетического материала, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

Зону детекции продуктов амплификации следует располагать как можно дальше от первых двух зон и исключить движение воздушного потока из третьей зоны в первую и вторую зоны. Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от первой зоны, к третьей.

Каждая зона лаборатории, где проводится ПЦР, должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, расходные материалы в каждой зоне

должны иметь соответствующую маркировку. Обработка рабочей одежды из каждой зоны должна производится раздельно. Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток; обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

Биологические образцы для выделения генетического материала должны храниться отдельно от набора реагентов для проведения ПЦР.

Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М., 1980.

Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

• каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для
обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет,
70% этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), источники
ультрафиолетового излучения, эффективно инактивирующие ДНК-
матрицы;

• при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до
и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором,
затем 70% этанолом;

Следует полностью исключить проведение в ПЦР-лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, диагностирующихся в данной лаборатории.

Персонал, работающий в ПЦР-лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ПЦР-АНАЛИЗА

Забор клинических образцов должен проводиться только в одноразовые пластиковые пробирки; работать в одноразовых перчатках. Необходимо использовать для автоматических пипеток одноразовые наконечники с аэрозольным барьером; обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальную емкость с раствором, вызывающим деградацию ДНК (1 н НС1; 10% гипохлорит натрия или 10% хорной извести).

При постановке анализов, следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все пробы, включая контрольные, а затем раскапывать ее по пробиркам. Избегать вспенивания, образования аэрозолей во время шшетирования и центрифугирования. В каждый данный момент времени работать только с одной пробиркой, все остальные должны быть закрыты крышками. В момент открывания и закрывания пробирок не прикасаться к внутренней поверхности крышки руками и наконечниками пипеток. Во всех случаях постановки ПЦР следует применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированном помещении сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью. Оборудование, реактивы, халаты и т.д. данного помещения должны находится только в этой комнате и не попадать в другие лаборатории ПЦР-диагностики. Следует всегда помнить, что самым опасным местом контаминации продуктами ПЦР амплификации является зона, где проводится электрофоретический анализ и детекция результатов реакции.

Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260нм; облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

-

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Льюин Б. /Гены - М: Мир. -1987. - С. 3-317.

2. Баев А. А-. Программа "Геном человека", ее возникновение, содержание
и развитие// Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Геном человека. -
1990.-Т.1.-С. 4-33.

3. Маниатис М., Фрич Э., Сэмбрук Дж. / Методы генной инженерии.
Молекулярное клонирование.-1983.-с. 157-180.

4. Молекулярно-клиническая диагностика. Методы. /М: Мир.-1999.-
С.302-328, С.507-532

5. Горбунова В.Н., Баранов В.С./Введение в молекулярную диагностику и
генотерапию наследственных заболеваний.-Спб. Специальная
литература.-1997.-287 с.

6. Иванов П. Л. др. Применение геномной "дактилоскопии" для
диагностика монозиготности близнецов// Судебно-медицинская
экспертиза - 1991 -. N.1. - С. 30-33.

7. Моляка Ю. К. и др. Генотипоскопия ДНК в определении спорного
отцовства: использование гибридиционных зондов// Генетика. - 1997. -
т. 33.-N. 6.-С. 831-835.

8. Пузырев В. П. Геномные исследования и болезни человека//
Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №. 5. - С. 19-28.

9. Рогаев Е. И. и др. Сравнение последовательностей митохондриальной
ДНК Т. Н. Куликовского- Романова, племянника царя НиколаяП
Романова, и ДНК предполагаемых останков царя// Генетика. - 1996. - т.
32.-№. 12.-С. 1690-1692.

10.Рысков А. П. Геномная "дактилоскопия"//Информационый бюллютень:

"Геном человека". -М.: 1990. - № 3.- 46 с. 11.Янковский Н. К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива,

или опыт исследования останков семьи последнего Российского

императора// Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 2. - с.

21-28. 12.Чемерис А.В., Ахунов А.Д., Вахитов В.А./Секвенирование ДНК.-

М.Наука,-1999.-429с. 13.Majumder. DNA fingerprinting for forensic identification: Some statistical

issues // Elecnrophoresis. - 1995. - v. 16. - p. 1684-1688 14.Miesfeld R., Rrystal M., and Arnheim N. A member of a new repeated

sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found

between the human delta and beta globin genes// Nucleic Acids Res.- 1981.-

v. 9.-p. 5931-5947. 15.ThePCRTechnique: RT-PCR/BioTechniquesBooks.-1998-300с

СОДЕРЖАНИЕ