Стволовые клетки в медицине

Применение стволовых клеток для восстановления органов. Одно из самых впечатляющих применений плюрипотентных клеток человека – это так называемая «клеточная терапия». Многие заболевания человека обусловливаются нарушением функционирования клеток или целых органов, и сегодня для устранения дефекта в таких случаях используется метод трансплантации. К сожалению, нередко повреждения носят множественный характер, и заменить все затронутые ими органы не представляется возможным. Плюрипотентные клетки, стимулированные к дифференцировке с образованием строго специализированных клеток, могут служить возобновляемым источником клеток, замещающих дефектные клетки. Это открывает широкие возможности для лечения самых разных заболеваний человека, включая такие серьезные, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, диабет и др. Не зря одна из статей в журнале «Cell» («Клетка») называется «Стволовые клетки: Возрождение надежд» (одно из значений американского словосочетания «new lease on life») [41].

Рис. 5.12. Основные направления использования стволовых клеток в научных исследованиях и медицинской практике [38].

Изолированные плюрипотентные клетки человека – ценный материал для исследователей и клиницистов. Эксперименты с их использованием могут помочь разобраться в сложнейших процессах развития человеческого организма, в частности в том, что именно влияет на переход клетки от стадии роста и деления к стадии дифференцировки. Известно, что ключевым моментом здесь является «включение» и «выключение» специфических генов, но в понимании деталей этого процесса еще много неясного. Изучив функционирование клетки в норме, можно будет понять, какие сбои в ее работе приводят к фатальным для организма последствиям.

Выделение плюрипотентных клеток человека открывает также новые возможности при поиске новых лекарственных веществ и их тестировании. Разнообразные клеточные линии (например, линии раковых клеток) используются в этих целях уже сейчас, а культура плюрипотентных клеток позволяет проводить тестирование сразу на нескольких типах клеток. Это не заменяет тестирование на уровне целого организма, но значительно облегчает и ускоряет поиск новых лекарственных веществ.

С помощью ЭСК разрабатываются эффективные технологии лечения многих наследственных заболеваний, которые не удалось решить методами молекулярной генетики, включая средства генной терапии. В целях экстренной помощи (например, при острой недостаточности органа) обоснованы и допустимы трансплантации аллогенных стволовых клеток, которые в определенных условиях микроокружения способны дать ростки донорской ткани в органе-реципиенте в количестве, достаточном для компенсации генетического дефекта. Всего 3-5% генетически нормальных клеток достаточно, чтобы восстановить утраченную биохимическую функцию поврежденной печени, скелетной мышцы, эндокринной железы. Проблемы использования эмбриональных стволовых клеток обсуждаются в многочисленных статьях, в частности, можно рекомендовать обзор [42] в журнале «The New England Journal of Medicine», который имеется в свободном он-лайновом доступе.

Что тормозит применение методов стволовых клеток в клинике? Во-первых, необходимо выяснить, какие события предшествуют переходу клетки в организме человека к стадии дифференцировки, – тогда можно будет управлять ходом событий, получая из плюрипотентных клеток именно те клетки, которые нужны для трансплантации. Во-вторых, следует решить проблему иммунологического отторжения. Поскольку плюрипотентные клетки, взятые из бластоцисты или ткани плода, вряд ли будут идентичны клеткам реципиента, необходимо научиться модифицировать их для минимизации этого различия или создать банк тканей.

В некоторых случаях проблему несовместимости удается решить, используя метод переноса ядра соматической клетки. Предположим, что пациент страдает прогрессирующей сердечной недостаточностью. Если взять у него любую соматическую клетку и ввести ее ядро в лишенную собственного ядра яйцеклетку-реципиент, мы получим химерную яйцеклетку, у которой практически весь генетический материал идентичен таковому у пациента. Из нее можно получить бластоцисту, а затем, отобрав клетки внутренней клеточной массы, – плюрипотентные клетки. Последние можно стимулировать к образованию клеток сердечной мышцы, идентичных в генетическом отношении нормальным клеткам пациента, и имплантировать их больному без необходимости подвергать его иммуносупрессорной терапии, чреватой серьезными последствиями. Однако на практической реализации этого пути тоже встречается большое количество подводных камней. В частности, необходимо научиться перепрограммировать соматическое донорское ядро, возвращая такие его характеристики как метилирование ДНК, гистонная модификация и, прежде всего, структура хроматина к состоянию, свойственному ядру недифференцированной эмбриональной клетки.

Лечение заболеваний сердца. Предварительные эксперименты на мышах показали, что трансплантация нормальных клеток сердечной мышцы животным, страдающим сердечной недостаточностью, приводит к частичной замене пораженных клеток и восстановлению сердечной деятельности. При этом не наблюдалось никакого отторжения донорных клеток клетками-хозяевами. Аналогичной процедуре можно подвергнуть и человека, страдающего сердечной недостаточностью, используя в качестве трансплантата клетки сердечной мышцы, полученные из плюрипотентных клеток человека.

Лечение заболеваний костной системы. Введение полученных из стволовых клеток остеобластов (предшественники клеток кости) в зону перелома значительно ускоряет процесс сращивания кости, а введение хондробластов (предшественники клеток хряща) в суставную сумку стимулирует регенерацию хряща на суставных поверхностях.

Лечение тканевых дефектов. Эпидермис – классический пример ткани, самообновляющейся благодаря функционированию стволовых клеток. Здесь разработаны методы получения чистой популяции базальных клеток в культуре и реализовано разделение различных субпопуляций по их фенотипу и поведению во время регенерации. Для изучения стволовых и прогениторных клеток использованы предполагаемые маркеры стволовых клеток р63 и К19, а также выброс ядерного красителя Hoechst 33342.

Полученные результаты позволяют заключить, что в культуре базальных кератиноцитов сохраняется популяция клеток, которые по ряду признаков могут быть отнесены к стволовым. В базальных кератиноцитах человека обнаружена экспрессия нестина. Кроме этого, разработаны методы для изучения в культуре длительно сохраняющих метку клеток. Обнаружена значительная гетерогенность клеток базального слоя эпидермиса по кинетическим и морфологическим параметрам. Разработаны тканевые трансплантаты, содержащие базальные кератиноциты человека, которые успешно использованы для лечения различных тканевых дефектов.

Лечение диабета. У больных, страдающих диабетом I типа, нарушена секреция инсулина специализированными, так называемыми островковыми клетками поджелудочной железы, и такие больные нуждаются в инъекциях инсулина. Есть данные о том, что трансплантация таким больным целой поджелудочной железы или островковых клеток позволяет существенно снизить дозу препарата. Островковые клетки, полученные из плюрипотентных клеток человека, можно использовать как в исследовательских целях для изучения диабета, так и для клеточной терапии.

Мобилизация донорских и эндогенных стволовых клеток. Мобилизация стволовых клеток – стимуляция миграции (выхода) стволовых клеток в кровоток с применением ростовых факторов, в частности специальных цитокинов. Для гемопоэтических стволовых клеток факторы мобилизации – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и гранулоцитарномакрафагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ). Например, в клинической кардиомиопластике при лечении ишемической болезни сердца перспективным представляется применение в качестве мобилизующих факторов Г-КСФ и интерлейкина ИЛ-2.

ЭСК: законодательство и биоэтика. После создания методов генной инженерии, рекомбинантных технологий переноса ДНК между клетками разных видов, завершения программы «Геном человека», получения первых линий ЭСК человека возникла новая биоэтика фундаментальных процессов, стоящих у истоков индивидуальной жизни. Эти новые реальности биоэтики нашли отражение в документе ЮНЕСКО: Биоэтика: международные аспекты (октябрь, 2001). Подборку статей по юридическим и биоэтическим проблемам использования стволовых клеток можно найти в юбилейном выпуске журнала «Человек» (№ 1 за 2005 г.: см. также их он-лайновую версию [43]).

В принятой ЮНЕСКО Универсальной декларации о геноме человека и правах человека (1999 г.) в статье 12 постулируется: «Свобода научных исследований, необходимых для прогресса знаний, есть часть свободы мысли. Практическое приложение знаний генома человека должно быть направлено на уменьшение человеческих страданий, улучшения здоровья как индивидов, так и всего человечества». Разработки с геномом ЭСК – часть этой общей стратегии.

В частности, по информации EUobserver.com, министры по охране окружающей среды ЕС окончательно одобрили рекомендации ЕС по развитию генной терапии, оставляя за государствами-членами право наложения запрета на исследование эмбриональных клеток человека по этическим причинам. Законопроект, принятый 30 октября 2007 г., содержит технические детали о регулировании на уровне ЕС видов так называемой “углубленной терапии” – генной терапии, терапии стволовыми клетками взрослого организма и тканевой инженерии. Эта практика в настоящий момент законна только в нескольких странах – в том числе в Британии, а новые правила поддерживают право каждого государства-члена ЕС на запрет как исследований, так и продажу лекарств, которые получают из клеток человеческих эмбрионов [44].

Генная терапия с использованием стволовых клеток. Дискуссии об этичности клонирования человека и получении линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) для "терапевтического" клонирования продолжаются и в настоящее время. Большинство специалистов отмечают, что возможность такого клонирования во многом лишь теория, пока только частично подтвержденная на практике. Наиболее перспективно использование комплексного подхода, сочетающего применение технологии ЭСК и генотерапии одновременно.

В подтверждение этого тезиса американские ученые из Института Уайтхед смогли продемонстрировать перспективность комплексного подхода, названного ими "клеточной терапией", при лечении наследственных заболеваний. Им удалось практически полностью восстановить иммунитет у мышей, страдающих серьезным наследственным иммунодефицитом, одновременно используя полученные в ходе "терапевтического клонирования" ЭСК и вводя животным их собственные гематопоэтические клетки с векторами, несущими определенные гены. В результате уже через две недели мыши из опытной группы были практически здоровы, в то время как существенных изменений у животных из контрольных групп не наблюдалось.

Еще более впечатляющее применение стволовых клеток человека – генная терапия ex vivo. В этом случае в организм больного можно ввести не обычные стволовые клетки, а генетически модифицированные, которые замещают дефектные клетки или восполняют недостаток продукта того гена, который включен в геном вводимых клеток. Стволовые клетки можно получать от самого пациента или от совместимых с ним доноров. Следует отметить, что генная терапия ex vivo с применением стволовых клеток человека делает лишь первые шаги. Более реальным является использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных животных. Соответствующие эксперименты уже широко проводятся на мышах (рис. 5.13).

Сначала получают эмбриональные стволовые клетки из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их генетически модифицируют с помощью вектора, несущего нужный ген (трансген), культивируют и отбирают тем или иным способом. Полученную популяцию клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатной» матери. Скрещивая животных, несущих трансген в клетках зародышевой линии мыши, получают линию трансгенных мышей.

В геном стволовой клетки можно не только встроить полезный ген, кодирующий какой-либо необходимый организму продукт, но и направленным образом вывести из строя («нокаутировать») ген, кодирующий, например, какой-нибудь токсин. Трансгенных мышей с нарушениями в определенном гене широко используют в качестве модели для изучения заболеваний человека на молекулярном уровне. Именно разработка и широкое применение метода «генного нокаута» стала одним из оснований присуждения Нобелевской премии 2007 г.

Сайты и базы данных по стволовым клеткам и клеточным технологиям. Банки эмбриональных стволовых клеток. Существует огромное количество ссылок на сайты и базы данных по стволовым клеткам и клеточным технологиям, включая международные журналы, находящиеся в свободном доступе. Только в Рунете на начало марта 2008 г. поиск по словам «стволовые клетки» и «базы данных» выдал 182000 ссылок, на слова «банки стволовых клеток» – 39600 ссылок. В качестве примера можно привести сайт нашей лаборатории по старению [45], международный журнал «Cell» [46], информационный сайт КлеткаРу [47], банки стволовых клеток [48–49]. Что касается конкретно банков стволовых клеток человека, то, по определению, – это система специализированных учреждений, основной задачей которых является подготовка образца к криоконсервации и длительное, практически не ограниченное во времени, хранение ранее заготовленных стволовых клеток, вне зависимости от источника их получения. Существуют две системы банков стволовых клеток: банки персонального хранения и донорские банки. В банках стволовых клеток персонального хранения находятся клетки для конкретного реципиента. В донорских банках стволовые клетки хранятся для аллогенных трансплантаций. По данным Интернет-журнала «Коммерческая биотехнология» [50] на конец 2005 г. лицензии Росздравнадзора на осуществление забора и хранения клеточного материала ("Банк стволовых клеток") имели только 10 учреждений: восемь Москве и по одному в Санкт-Петербурге и Самаре.