Рекомбинация и картирование генома

Принципы и методы картирования генома. На сегодняшний день не существует четкой классификации методов картирования. Так, например, одни авторы относят цитогенетические методы (FISH, PRINS и т.п.) к генетическим методам, другие к физическим. По сути все методы являются генетическими, так как конечный результат картирования - получение максимально подробной карты взаимного расположения структурных, функциональных и полиморфных последовательностей генома и определение расстояний между ними. Тем не менее, в зависимости от использования при составлении карт генома тех или иных подходов, используется следующая классификация методов картирования.

Генетическое картирование – это картирование, основанное на методах классической генетики – определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ).

Цитогенетическое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты.

Физическое картирование – это обширная группа методов, позволяющая строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.

Генетическая рекомбинация и груп­пы сцепления. Рассмотрим подробнее генетическое картирование и лежащее в его основе явление генетической рекомбинации. Генетической рекомбинацией назы­вается процесс перераспределения генетической инфор­мации у потомков. В основе его лежит явление кроссинговера (перекреста) и обмена частями гомологичных хромосом во время мейоза. Как можно наблюдать рекомбинацию? Допустим, что в гомологичных хромосомах находятся два гена – A, B и их аллели а, b. Пусть, далее, оба родителя гомозиготны по этим генам, т.е. имеют фенотипы АВ и ab соответственно. В результате скрещивания исходных родительских форм все гибриды первого поколения будут иметь фенотип АВ. Во втором поколении по менделевскому правилу расщепления у нас должны проявиться оба родительских фенотипа в отношении 3 АВ: 1 аЬ. Рекомби­нация приводит к тому, что это соотношение не выполня­ется, ибо мы получаем еще две формы со смешанными фе­нотипами Ab и аВ. Если количество особей с родительски­ми признаками обозначить через Р ₁ +Р ₂, а с рекомбинантными – через R ₁ +R ₂, то частота рекомбинации rf (от английского “recombination frequency”) определяется пред­ложенной Г. Меллером (см. воспоминания А. Стертеванта [25]) формулой:

rf = (R ₁ +R ₂)/(Р ₁ +Р ₂ + R ₁ +R ₂). (6)

Величина rf может меняться в пределах от 0 до 0,5; rf =0 означает полное сцепление признаков, rf =0,5 – независимое их наследование.

Как ни покажется это странным, именно рекомбинация, т.е. нарушение сцепления генов, позволила выяснить принципы организации генов в хромосомах. Честь этого открытия принадлежит А. Стертеванту [26]. Основываясь на анализе рекомбинации у дрозофилы, он предположил, что гены внутри хромосомы расположены в линейном порядке, и в 1913 г. создал первую генетическую карту. При ее построении (картировании) А.Стертевант исходил из того, что если частота рекомбинации между генами A и В равна rf_AB, между генами В и С – rf_BC, то частота рекомби­нации между генами A и С подчиняется закону аддитив­ности:

rf_AC = rf_AB ± rf_BC. (7)

Знак плюс означает при этом, что гены располагаются в последовательности А—В—С, минус свидетельствует о последовательности А—С—В. Мерой расстояния между генами служит частота рекомбинации.

Как картирование осуществляется практически, может проиллюстрировать такой пример. У дрозофилы в одной из хромосом лежат рецессивные аллели, определяющие недоразвитость щетинок (h), изогнутые крылья (с) и чер­ную окраску тела (е). Доминантные аллели, лежащие в гомологичной хромосоме, – это гены, дающие развитые щетинки (h ⁺), прямые крылья (c ⁺) и бурую окраску тела (e ⁺). Для картирования используют скрещивание особей hcе и h⁺c⁺e⁺. При этом оказывается, что у 20,7 % потом­ков кроссинговер произошел на участке h—с, а на отрезке с—е – у 17,5%. Наконец, у 3% особей наблюдается сразу два кроcсинговера. Таким образом, на отрезке h—с в общей сложности произошло 20,7%+3%=23,7% кроссинговеров, а на участке с — е – 17,5%+3%=20,5%. Если принять положение гена h за нуль, то в соответствии с формулой (7) получаем такую последовательность генов (в скобках – их расстояние от выбранного начала в про­центах рекомбинации): h (0) — c (23,7) — е (44,2). Так были построены карты хромосом дрозофилы и многих других организмов.

Описываемый формулой (7) закон аддитивности явля­ется одним из крупнейших после Менделя достижений генетики. Из него следует существование линейной зависимости между процессом ре­комбинации и физическим расстоянием между генами: rf =αl. где α – коэффициент пропорциональности, а l – физическое расстояние. Одна­ко сам же Стертевант пока­зал, что закон аддитивности в форме (7) выполняется с достаточной точностью толь­ко в том случае, когда обе составляющие (и rf_AB, и rf_BC) не превосходят 10 %. На более длинных участках хромосомы эксперименталь­ное значение rf_AC всегда меньше теоретически ожидае­мого.

Стертевант предположил, что нарушение закона адди­тивности на больших расстояниях вызвано двойными кроссинговерами. В самом деле, как видно на рис. 3.8, второй кроссинговер в интервале между генами В и С ликвидирует последствия первого, происшедшего на участке АВ. По­этому рекомбинанты по генам A и С не появляются. В силу того, что обмены распределены по хромосоме случайным образом, рекомбинанты по A и С появляются только в тех случаях, когда кроссинговер состоялся в интервале АВ или ВС, но не в обоих одновременно:

rf_AB = rf_AB (1– rf_BC) + rf_BC (1– rf_AB). (8)

Эта формула впервые была получена А. Троу вскоре после открытия закона аддитивности и носит его имя (цитируется по монографии [27]).

Обобщая предположение о роли двойных и одиночных кроссинговеров в рекомбинации, можно сказать, что лю­бое четное число обменов между генами не приводит к по­явлению рекомбинантов по ним, любое нечетное – приво­дит. На достаточно длинном участке хромосомы число четных кроссинговеров равно числу нечетных и rf =0,5. Поэтому для длинных интервалов частота рекомбинации уже не может служить мерой расстояния. Для того, чтобы совершить переход от rf к l, необходимо построить картирующую функцию. Эту задачу выполнил Дж.Б. Холдейн в 1919 г. [28]. Он исходил из следующих соображений.

Пусть точки обменов распределены по хромосоме слу­чайным образом, причем средняя их плотность постоянна и равна ν. Тогда на участке длиной l в среднем произойдет νl обменов. Вероятность того, что на этом участке будет точно п кроссинговеров, дается формулой Пуассона:

P_n (l) = (vl) ⁿe ^{– vl} / n!, n = 0, 1, 2, … (9)

Рекомбинанты появляются только при не­четном n, поэтому получаем:

_¥

rf (l) = Σ P_{2n +1}(l) = ½ (1 – e ^{–2 vl} ). (10)

^{n =0}

Картирующая функция Холдейна (10) совпадает с формулой Стертевента rf = νl только до значений rf»0,l (см. рис. 3.9).

Рис. 3.9. Картирующая функция Холдейна.

Эта модель описывает идеаль­ную картирующую функцию. Для реальных организмов необходимо учитывать многие факторы, в частности закон интерференции, говорящий о неслучайном распределении точек кроссинговера по хромосоме. Поэтому для построения карт обычно пользуются методом последовательного сум­мирования частот рекомбинации, полученных на коротких интервалах, где rf<0,l. Карты сцепления показывают порядок линейного расположения генов и маркеров на хромосоме и генетическое расстояние между ними, выраженное в процентах рекомбинации – сантиморганах (сМ). Считается, что два гена на хромосоме находятся на расстоянии 1 сМ, если вероятность рекомбинации между ними в процессе мейоза составляет 1%. Карта генетического сцепления составляет около 2809 сМ для мужчин и 4782 сМ для женщин. Меньший "размер" мужского генома объясняется тем, что частота рекомбинации в сперматогенезе меньше, чем в оогенезе. Средняя длина генома человека в единицах генетического расстояния составляет около 3300 сМ. Сопоставив эту величину с размером гаплоидного генома человека, оцениваемым в 2,91 млрд.п.н., можно заключить, что на 1 сМ генетической карты приходится в среднем немногим менее 1 млн.п.н. ДНК на физической карте генома.

Рекомбинация как марковский про­цесс. Модель Холдейна создавалась в то время, когда еще не были известны, хотя бы даже в общих чертах, моле­кулярные механизмы рекомбинации. В модели предпола­галось, что рекомбинация осуществляется путем разрывов хромосом, обменов гомологичными участками и последую­щего воссоединения целостных структур. Такой механизм справедлив для высших организмов и носит назва­ние реципрокной рекомбинации. Однако со временем стало ясно, что такой симметричный обмен генетической инфор­мацией осуществляется далеко не всегда. В общем случае за нереципрокность рекомбинации отвечает целый ряд открытых на микроорганизмах молекулярных механизмов.

Одним из первых внимание на это обратил американ­ский исследователь Т.Г.Вуд, построивший математиче­скую модель асимметричной рекомбинации. В основе ее лежали представления о том, что в процессе рекомбинации осуществляется синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), при котором происходит переход с одной хромосомы-матрицы на другую. Его сотрудник Р.Г. Волмсли в 1969 г. развил общую модель нереципрокной рекомбинации, рассматривая ее как марковский про­цесс [29].

Если родители обладают двумя диаллельными генами А (а) и В (b), у них должно появиться четыре класса потом­ков: АВ, Аb, аВ и ab. Для описания частот их появления Волмсли ввел четыре картирующие функции: две функции рекомбинации для потомков Аb и аВ и две функции сцеп­ления для потомков АВ и ab, обозначив их соответственно Р^f_М, Р^m_F, Р^m_М и Р^f_F. Символы М (т) и F (f) обозначают от­цовские и материнские гены соответственно. Большими буквами М и F обозначаются гены, расположенные пер­выми, малыми буквами т и f – гены, лежащие за ними. Таким образом, функция Р^f_м (х), например, определяет вероятность того, что в хромосоме потомка на расстоянии х от отцовского гена будет обнаружен материнский.

Из этих четырех функций ассоциации, как назвал их Р.Г. Волмсли, составляются разнообразные марковские цепи. Исследовав свойства этих цепей, можно вывести систему дифференциальных уравнений, которым подчиняются че­тыре функции ассоциации. Упрощенный способ выведения этих уравнений изложен в нашей книге [30], поэтому здесь ограничимся лишь конечными формулами:

ν _fr ν _mr

P^m_M (X) = ––––––– [1 + ––– EXP{–(ν _fr + ν _mr) X }],

ν _fr + ν _mr ν _fr

ν _mr

P^f_M (X) = ––––––– [1 – EXP{–(ν _fr + ν _mr) X }],

ν _fr + ν _mr

(11)

ν _mr ν _fr

P^f_F (X) = ––––––– [1 + ––– EXP{–(ν _fr + ν _mr) X }],

ν _fr + ν _mr ν _mr

ν _fr

P^m_F (X) = ––––––– [1 –EXP{–(ν _fr + ν _mr) X }],

ν _fr + ν _mr

где знак EXP(X) обозначает экспоненту e^x.

В случае симметричной рекомбинации ν _mr = ν _fr = ν и четыре функции редуцируются в две:

Р^f_м = Р^m_F = ½ (1 – e ^{–2 vx} ), Р^m_м = Р^f_F = ½ (1 + e ^{–2 vx} ). (12)

Первая из них характеризует рекомбинацию и совпадает с холдейновской функцией (10), вторая описывает сцеп­ление.

Генетическое картирование. До недавнего времени изучение геномов было возможно только путем генетического анализа – построения генетических карт или карт сцепления (linkage map). Генетической картой хромосомы называют относительное положение генов, находящихся в одной группе сцепления. Сначала формируются группы сцепления генов и исследуется их взаимное расположение. Основным методом построения карт сцепления является классический генетический анализ, т.е. анализ наследования признаков в родословной, а также изучение частоты рекомбинации генных локусов в мейозе [31].

До начала 70-х годов ХХ века построение генетических карт человека шло очень медленными темпами. Небольшой размер семей, длительный период одного поколения, ограниченное число информативных родословных и отсутствие методов эффективного цитогенетического анализа всех пар хромосом затрудняло этот процесс. Первый ген человека был локализован на Х-хромосоме в 1911 г., а первый аутосомный ген – только в 1968 г. К середине 1970-х годов было локализовано менее 100 генов, причем значительная часть из них располагалась в Х-хромосоме.

Прогресс в генетическом картировании генома человека связан с мутантными генетическими линиями животных (в большинстве случаев это мыши), моделирующими различные наследственные заболевания человека. При этом используются культивирование эмбриональных стволовых клеток, сайт-специфическое разрушение генов или введение в них определенных мутантных аллелей in vitro, отбор клонов с генетическими модификациями и пересадка их в ранние зародыши. Высокий процент сходства по нуклеотидным последовательностям между кодирующими областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также большое число консервативных групп сцепления с идентичным расположением генов, так называемых синтенных групп сцепления, позволяет проводить параллельные исследования на модельных объектах, значительно ускоряющие эффективность картирования и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.

Дальнейший прогресс в области генетического картирования связан с деятельностью крупных научно-исследовательских центров по созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее интересные и обширные родословные. Так, в Центре по изучению полиморфизма человека – CEPH (от фр. Centre d'Etudes du Polymorphysme Humain) создана уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур, полученных от членов семей, многоступенчатые родословные которых насчитывают десятки и даже сотни индивидуумов. СЕРН-коллекции представляют собой идеальные системы для генетического анализа наследственных признаков. Усилиями исследователей из разных стран мира были определены генотипы членов СЕРН-семей по тысячам полиморфных локусов и построены соответствующие генетические карты.

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, о локализации и функциях отдельных генов и о структуре генома в целом вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джонса- Хопкинса в Балтиморе (США) под руководством профессора Виктора Мак-Кьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, издание энциклопедий под названием: "Менделевское наследование у человека: каталог генов человека и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in men. Catalog of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes").

Цитогенетическое картирование. Методы дифференциального окрашивания позволяют идентифицировать на препарате как отдельную хромосому, так и любой участок хромосомы, выявляя окрашенные зоны – так называемые бэнды. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируются около 750 бэндов, на прометафазных хромосомах 2500–3000. Уже разработаны методы многоцветной окраски – multicolor banding (до 25 цветов) интерфазных и метафазных хромосом. Цитогенетические карты показывают локализацию маркера с точностью до определенной хромосомы, плеча или хромосомного сегмента. Этот тип карт показывает линейный порядок маркеров в хромосоме. По разрешающей способности они занимают промежуточное положение между генетическими картами и физическими картами.

Определение хромосомной и субхромосомной локализации маркеров проводят с использованием гибридов соматических клеток между различными видами млекопитающих или непосредственной гибридизации in situ уникальных молекулярных зондов на митотические хромосомы. К методам цитогенетического картирования относятся также хромосомный сортинг (проточная цитометрия), микродиссекции и микроклонирование определенных геномных фрагментов и сравнительное генетическое картирование (сравнительная цитогенетика). В 1990-е годы метод гибридизации in situ получил развитие в модификациях: FISH (гибридизация in situ с использованием флюоресцентной метки) и PRINS (метод, сочетающий гибридизацию in situ на метафазных хромосомах специфических праймеров с последующей ПЦР, включающей меченый биотином нуклеотид в продукт амплификации). Этот подход стал основным методом для построения цитогенетических карт.

Физическое картирование.В отличие от генетических карт, построенных на основе групп сцепления и дающих статистические расстояния между ДНК-маркерами и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния между маркерами в каждой хромосоме. К методам физического картирования относятрестрикционное картирование, RH-картирование, клонирование в YAC(от англ.yeast artificial chromosome),BAC(от англ.bacterial artificial chromosome), космидах, плазмидах и других векторах иконтиг-картированиена их основе, а такжесеквенирование ДНК.Использование искусственных хромосом создает основу для проведения физического картирования как на хромосомном, так и на субхромосомном уровне.

Основой физического картирования генома является построение физических карт, т.е. определение порядка расположения физических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физических маркеров могут выступать сами гены, анонимные фрагменты ДНК (D-сегменты), точки расщепления ДНК рестриктазами и т.д. Однако при развитии работ по физическому картированию исследователи столкнулись с трудностями при совмещении данных. Для преодоления этой проблемы в 1989 г. было предложено стандартизовать все обозначения меченных последовательностей ДНК в геноме, включая все типы последовательностей, будь то просто картированный сегмент ДНК с неизвестной функцией (D-сегменты), последовательность с необычными сайтами рестрикции, проба, выявляющая полиморфизм, последовательность, гибридизующаяся с определенным "бэндом" при гибридизации in situ или STS-маркеры (от англ. "sequenсed tagged site").

Существуют разные стратегии физического картирования, например:

Контиг-карты хромосом человека на основе перекрыващихся клонов геномной ДНК человека. Одним из методов высокого разрешения является построение контиговых карт перекрывающихся клонов. Контиговая карта, или контиг (от contigous - протяженный) - включает в себя набор перекрывающихся клонированных фрагментов геномной ДНК в комплексе с информацией о порядке их перекрывания. Локализовать клонированный фрагмент можно, применяя методы гибридизации с пробами ДНК, локализация которых известна, ПЦР-анализ, секвенирование.

Картирование методом дробовика (ShotGun) и картирование с использованием случайных STS. Данная стратегия картирования предполагает секвенирование коротких случайных фрагментов генома человека и подбор ПЦР-праймеров к этим фрагментам, т.е. создание STS. Используя радиационные гибриды или иные системы, в том числе соматические гибриды и семьи полиморфных маркеров CEPH, можно определить положение STS на физической и генетической карте генома человека. Недостаток данного подхода - невозможность оценить истинное расстояние между STS-маркерами, что сильно снижает разрешающую способность получаемых карт.

Картирование с использованием панелей радиационных гибридов соматических клеток (RH-картирование). Для получения карт высокого уровня разрешения используется стратегия картирования с помощью радиационных гибридов (RH-картирование, radiation hybrids mapping). На сегодняшний день RH-картирование получило очень широкое распространение и применяется исследователями в различных целях: для тотального картирования, для составления карт индивидуальных хромосом или участков хромосом человека на основе хромосом-специфичных RH-панелей, для установления мест локализации конкретных генов или STS, EST и других типов маркеров.

Компьютерные базы данных. Мы уже писали в Главе 2, что существует большое количество Web-сайтов с базами молекулярно-биологических данных. К числу наиболее полных и авторитетных по части картирования генома человека относятся NCBI [32], Genethon [33], CEPH-Genethon [34], GDB (Genome Data Base) [35].