Репликация вирусов с линейными одноцепочечными ДНК
Parvaviridae (parva - мелкий).
Поражают насекомых и животных, в т.ч. и человека. Не имеют липопротеидной оболочки, капсид икосаэдрический, Ø25 нм. Геном представлен линейной одноцепочечной ДНК длиной 5±0,5 т.нт. Размножаются в ядре в S-фазе клеточного цикла.
Парвавирусы животных можно разделить на две группы:
I. По степени автономности.
а) Автономные. Имеют все компоненты для самостоятельного размножения, для некоторых показана аденовирусная стимуляция;
б) Аденоассоциированные. В геноме два гена, кодирующие белки оболочки и Rep-белки, разнообразие продуктов экспрессии достигается за счет альтернативной инициации транскрипции и альтернативного сплайсинга транскриптов. Дефектны в отношении воспроизводства, но возможна стимуляция репликации: в присутствии канцерогенов, коинфекция аденовирусами (помощь на уровне транскрипции), в ряде случаев – коинфекция герпес-вирусами (помощь на уровне репликации).
Размножение аденоассоциированных парвавирусов подавлено белком Rep (связываясь с промотором, он подавляет транскрипцию, которая нужна для вырезания интегрировавшегося вируса, и помощь со стороны аденовирусов заключается в поставке белков, превращающих его в активатора транскрипции). Мутации в промоторе гена Rep могут сделать аденоассоциированные вирусы автономными.
II. По значимости цепи. Это условное деление, т.к. в некоторых случаях белок может кодироваться (–) цепью.
(+) или (–) цепи. Аденоассоциированные вирусы. При выделении может происходить отжиг цепей, в связи с чем раньше считали, что они двуцепочечные.
(-) цепи. Автономные вирусы.
Самозатравочный механизм репликации аденоассоциированных парвавирусов
На концах имеются повторы длиной 145 нт., образующие шпилечные структуры, поэтому репликация начинается сразу со стадии элонгации. ДНК синтезирует клеточная ДНК-полимераза. Тогда, как решается проблема репликации концов?
Смитт предложил решение.
В репликации концов участвует полифункциональный вирусный белок – Rep. Rep-белок способен к олигомеризации. Он узнает участок в районе шпильки, вносит одноцепочечный разрыв между 125 и 126 нт. и при этом остается ковалентно связанным с 5’-концом. Далее Rep-белок действует как хеликаза, расплетая шпильку. Образовавшийся 3’-конец используется клеточной полимеразой в качестве затравки для достраивания второй цепи.
|
a c C b B A 5’
A C c B b a 3’
| |
Внимательно посмотрев на 3’-конец второй цепи, можно понять, что произошла инверсия порядка участков.
Узнавание концевой структуры.
После элонгации репликации возможно образование одноцепочечного кольца, благодаря лигазной активности Rep, но преимущественно образуется линейный двуцепочечный продукт. В последнем случае говорят о переносе шпильки на концах.
Благодаря самокомплементарности концевых участков, в двуцепочечных продуктах возможно образование структур, называемых «заячьими ушами». Однако, процесс невыгоден термодинамически, поэтому неясно, почему эти структуры все-таки образуются.
Появляется 3’конец, который может служить затравкой для синтеза ДНК. В ходе достройки цепи возможно образование двух наборов продуктов. Одну из цепей обозначим условно как (+)цепь, другую – как (–) цепь.
| Если на 5’-конце «заячьи уши» образовались до переноса шпильки на 3’-конце, то получается длинный продукт, содержащий два эквивалента генома.
| |
I.
II.
| | | | | | | | |
| | | | Если перенос шпильки прошел до образования «заячьих ушей», то получается продукт со шпилькой и вытесняется одноцепочечная геномная ДНК.
| |
| | |  |
| |
| |  |
| |
| | |  |
| |
| |
| | |  |
Одноцепочечная ДНК далее может вновь вступить в репликативный цикл или, при накоплении белков может упаковываться в вирусные частицы.
Ферменты и вспомогательные белки, участвующие в репликации парвавирусов:
DNApolδ мультисубъединичная высокпроцессивная ДНК-полимераза эукариот, RPA (аналог SSB прокариот) – белок связывающийся с одноцепочечными участками ДНК и стабилизирующий расплетенное состояние дуплекса ДНК, RF-С – белковый комплекс, загружающий фактор процессивности ДНК-полимеразы (аналог γ-комплекса прокариот), PCNA – гетеротримерный фактор процессивности ДНК-полимеразы (аналог β-субъединицы ДНК-полимеразы прокариот). Заметьте, что праймаза не участвует в репликации парвавирусов.
Кольцевые формы:
Шпилечную структуру может узнать Rep-белок и внести разрыв. Проблема в том, что шпилька есть только у одного конца, а на другом конце инвертированного повтора нет. Как достроить 3’ конец молекулы? Решение проблемы заложено в структуре ДНК: после синтеза дочерней цепи вытесненная цепь образует кольцо и 3’-конец достраивается по 5’-концу. Образуется полноценная геномная ДНК.
Геном аденоассоциированных вирусов состоит из двух генов. Однако при экспрессии этих генов за счет альтернативной инициации транскрипции и альтернативного сплайсинга образуются группы Rep-белков и белков оболочки.
Rep белок, как уже было упомянуто, является транскрипционным фактором, и последовательность, которую он узнает, находится внутри генома вируса. Недалеко есть сайт, подобный TRS, в который Rep-белок может случайно внести разрыв. Если такой разрыв будет внесен в кольцевую двуцепочечную форму, то ее репликация будет осуществляться по схеме, не отличающейся от схемы разматывающегося рулона.
Благодаря инверсии, возникающей при переносе шпильки, возможно образование нескольких геномов с различной ориентацией концевых участков. В случае (+) цепей таких вариантов существует 4, еще 4 для (–) цепей, итого 8.
Аденоассоциированные вирусы могут встраиваться в геном животных. Например, в геноме человека существует около 200000 тысяч возможных сайтов, но встраивание вируса происходит на определенном участке XIX хромосомы человека, потому что необходимо наличие в определенных положениях поледовательностей, способных служить TRS и RBE сайтами.
Для вырезания провируса необходима транскрипция вирусной ДНК, однако Rep-белок является репрессором транскрипции. Превратить его в активатор транскрипции могут белки аденовирусов, поэтому переход от лизогении к литическому циклу у аденоассоциированных вирусов возможен лишь при коинфекции аденовирусами.
Участки связывания Rep-белка можно изменить с помощью генноинженерных методов таким образом, что становится возможным вырезание провируса при участии клеточных резольваз, узнающих крестообразные структуры.
Аденоассоциированные вирусы пытаются использовать в генной инженерии.
