Молекулярно-генетические подходы в исследовании тонкого строения генов. Интрон-экзонная организация генов эукариот, сплайсинг

При изучении первичной структуры, т. е. последовательности нуклеотидов, ряда генов выяснилось, что в них, наряду с участками, кодирующими специфичный для этого гена продукт (полипептид, рРНК, тАНК и т. д.), имеются участки, которые ничего не кодируют, т. е. они подобно межгенным спейсерам (участкам между генами) не содержат генетической информации. Группы ученых, возглавляемых Р. Робертсом и П. Шарпом, обнаружили такие расщепленные гены у аденовируса 2 в 1977 г. Некодирующие участки получили название интронов, кодирующие - экзонов. Такой тип структурной организации обнаружен для множества генов, локализованных в хромосомах эукариот, для некоторых генов внутриклеточных органелл эукариот - пластид и митохондрий, а также для генов нескольких РНК-содержащих и ДНК-содержащих вирусов, поражающих эукариот. У бактерий интронов в генах нет. Нет интронов и в генах вирусов, поражающих бактерии. Число и внутригенная локализация интронов характерны для каждого гена, что стано вится очевидным в результате сравнения организации гомологичных генов у разных видов. Некоторые гены содержат только один-два интрона, но часто их значительно больше. Так, например, в гене овальбумина курицы 7 интронов, в гене сывороточного альбумина крысы их 13, а один из генов коллагена курицы имеет даже 51 интрон. По результатам проекта «Геном человека», в 17 тыс. исследованных транскриптов у этого вида среднее число экзонов на транскрипт составило 7,8. Летальное исследование экзонов у 10 наиболее изученных модельных объектов показало, что у эукариот в среднем один ген содержит 3,7 интрона на 1 тпн кодирующего участка ДНК. У низших эукариот, таких как дрожжи, 95 % генов содержат только один экзон, значит, такие гены не прерываются интронами. У дрозофилы таких генов всего 17%, а у млекопитающих — 6 %. Экзоны имеют, как правило, небольшую длину. Длина интрона может быть разной — от нескольких десятков пар нуклеотидов до многих тысяч. Общая длина всех интронов часто значительно превышает суммарную длину экзонов. К примеру, из приблизительно 7 т пн, образующих ген овальбумина, на долю экзонов приходится всего 1872 пн, т. е. почти,, 3/4 длины составляют интроны. По данным; проекта «Геном человека», только 1 % ДНК генома приходится на экзоны и 24 % — на интроны, при этом размер гена (экзоны + интроны) составляет около 28 т пн. Интроны транскрибируются наравне с экзонами, так что про-мРНК содержит участки, транскрибированные как с экзонов, так и с интронов. В дальнейшем в ходе процессинга, происходящего в ядре, участки про-мРНК, соответствующие интронам, вырезаются, а бывшие разобщенными участки, считанные с экзонов, «сращиваются», и зрелая мРНК содержит только транскрипты экзонов. Эти прежде разобщенные участки соединяются в нужном порядке. Воссоединение участков, транскрибированных с экзонов при образовании зрелой мРНК, называют сплайсингом. Длина гена существенно больше длины мРНК. Интроны всегда (установлено для генов, кодирующих белки) имеют на 5'-конце пару последовательностей СТ, а на 3'-конце — AG.

Последовательности нуклеотидов в экзонах консервативны, а в интронах сильно варьируют. Иногда экзон одного гена может быть гомологичным экзону даже другого гена. Например, два β-глобиновых гена мыши имеют по три гомологичных экзона в каждом гене. Между интронами этих генов гомология не найдена, повидимому, из-за того, что интроны эволюционируют значительно быстрее, чем экзоны. При сравнении последовательностей нуклеотидов в одних и тех же генах у разных видов находят большую гомологию в экзонах. Разные экзоны в пределах гена не только различаются по составу кодируемых ими аминокислот, но и имеют определенные структурные особенности. Например, в геноме человека обнаружено 30-45 тыс. так называемых CpG-островков. Это тяжи неметилированной ДНК с высоким содержанием динуклеотидов CpG. Чаще всего они располагаются в районах стартовых точек транскрипции. Вероятность найти CpG-островки в первых экзонах генов человека в 13 раз выше, чем в интронах, и в два раза выше, чем в других экзонах.

Структурная организация генома эукариот. Классификация повторяющихся элементов генома. Семейства генов. Псевдогены. Регуляторные элементы генома. Молекулярно-генетические методы картирования генома.

Псевдогены – это копии нормальных генов, лишенные интронов, несущие различные мутации. Их существование подтверждает саму возможность сохранения дупликатных копий генетических единиц, которые могут служить материалом для возникновения новых генов. У дрозофилы псевдогены встречаются редко, чаще это гены транспортных или малых ядерных РНК (тАНК, snRNA). В геноме человека, как полагают, не менее 3 тыс. последовательностей можно рассматривать в качестве псевдогенов. Главной отличие генетического материала эукариот от прокариотами - наличие избыточной ДНК. Существуют виды, геном которых в десятки раз больше генома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные растения. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В конце 60-х гг. американские ученые Р. Бриттен и Э. Дэвидсон открыли фундаментальную особенность молекулярной структуры генома эукариот — наличие последовательностей нуклеотидов разной степени повторяемости. Это открытие было сделано с помощью молекулярно-биологического метода изучения кинетики ренатурации денатурированной ДНК. Различают следующие фракции в геноме эукариот: 1. Уникальные последовательности, т. е. представленные в одном экземпляре. 2. Промежуточные (или среднечастотные) повторы. Это последовательности, повторяющиеся десятки и сотни раз. 10²-10⁵ копий. 3. Высокочастотные повторы, число которых в геноме достигает 10⁶ копий. Уникальные последовательности чаще всего представлены генами. Число генов у эукариот определяют одним из двух способов. Первый способ прямой, т. е. экспериментально определяют последовательности нуклеотидов во всем геноме, число последовательностей, содержащих длинные рамки считывания. Понятно, что такой анализ можно провести пока на очень ограниченном числе видов, главным образом тех, которые вовлечены в геномные проекты. Повторы образуют семейства — совокупность последовательностей, полностью или по большей части гомологичных друг другу. У эукариот не распространен оперонный тип расположения генов, т.е. объединение в блоки генов, находящихся под общим контролем. Гены, контролирующие даже последовательные биохимические реакции, расположены в разных районах хромосомы и даже в разных хромосомах. Например, у дрозофилы многие гены, кодирующие ферменты, под контролем которых происходит превращение триптофана в бурый глазной пигмент, разбросаны во множестве участков генома. Вместе с тем известны некоторые примеры кластерной организации генов. У человека существует несколько типов гемоглобинов. Каждый из них синтезируется на определенной стадии развития. Важное значение в картировании генов принадлежил молекулярно-генетическим подходам, которые явл-ся принципиально важным звеном для успешного совмещения карт сцепления и физических карт целых хромосом и их фрагментов. Точность цитогенетического картирования определдяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудования. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность картирования ограничивается одним крупным диском или даже сегментом хромосомы. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает.

Генетический контроль и молекулярные механизмы репликации. Полуконсервативный способ репликации ДНК. Полигенный контроль процесса репликации. Схема событий в вилке репликации. Понятие о репликоне. Системы рестрикции и модификации. Рестрикционные эндонуклеазы.

Для передачи дочерним клеткам генетической информации в процессе репликации ДНК должна быть создана копия генома. Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Эти ферменты используют в качестве шаблона одну из цепей двойной спирали ДНК, так называемую матрицу. На матрице, начиная с короткой стартовой последовательности (праймера), ферменты синтезируют комплементарную цепь и воспроизводят в итоге исходную двухтяжевую ДНК. Субстратами ДНК-полимераз являются четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата: аденозин-, гуанозин-, тимидин- и цитозинтрифосфаты. При каждом шаге синтеза ДНК происходит спаривание нуклеотида с соответствующим азотистым основанием матричной цепи. Затем α-фосфатная группа связанного нуклеотида подвергается нуклеофильной атаке со стороны 3'-ОН-группы предыдущего нуклеотида. За этим следует удаление дифосфата и образование новой фосфодиэфирной связи. Эти этапы повторяются снова и снова по мере движения ДНК-полимеразы от одного основания к следующему вдоль матрицы. В соответствии с этим механизмом матричная цепь ДНК считывается в направлении 3'→5'. В большинстве клеток имеется несколько ДНК-полимераз. Наряду с ферментами, которые осуществляют собственно репликацию, существуют полимеразы, которые включены в процессы репарации ДНК (см. с. 252) или реплицируют митохондриальную ДНК эукариот. Большинство ДНК-полимераз построены из множества субъединиц, роль которых до конца не выяснена. Расплетание нитей молекулы ДНК происходит с помощью особого белка – геликазы. Оно идет против витков спирали и совершается с огромной скоростью. При расплетании возникает суперспирализация и вращение ДНК, которое снимается группой ферментов, называемых топоизомеразами. Топоизомераза I – вносит временный одноцепочечный разрыв перед репликативной вилкой, что позволяет спирали ДНК вращаться вокруг своей оси. После снятия напряжения разорванная цепь восстанавливается. Топоизомераза II – создает временный двуцепочечный разрыв, удерживая вместе оторванные друг от друга концы цепей. Присутствие этого фермента позволяет распутывать сложные переплетения и узлы. Затем на релаксированный участок родительской молекулы ДНК, с которого начинается репликация и который называется точной начала (или ориджином) репликации (ori C) садятся инициаторные белки. Синтез цепи ДНК всегда идет в направлении 5’→ 3’. Из-за того, что в родительской молекуле ДНК цепи антипараллельны, на одной из родительских цепей новая цепь синтезируется непрерывно в направлении 5’→ 3’, что совпадает с движением репликативной вилки. Это лидирующая (или ведущая) цепь. Другая растет за счет синтеза коротких фрагментов также от 5’к 3’, но они синтезируются в обратном направлении и носят название фрагментов Оказаки. На ДНК- матрице ДНК – праймаза синтезирует короткую РНК – затравку (праймер). Затем РНК – праймеры удлиняются действием ДНК – полимеразы III. На матрице отстающей цепи собираются SSB – белки, удерживая цепь в выпрямленном состоянии, затем синтезируются РНК – праймеры, которые удлиняются действием ДНК – полимеразы III, которая при этом вытесняет SSB – белки по мере синтеза нового фрагмента Оказаки. Фрагметны Оказаки сшиваются благодаря действию двух ферментов: ДНК–полимеразы I, продолжающей синтез в направлении 5’→ 3’, одновременно удаляя РНК – праймер, и ДНК – лигазы, достраивающей одноцепочечную брешь. Репликация осуществляются дискретно. Участок ДНК, в котором происходит индивидуальный акт репликации, называется репликоном. Репликон содержит все регуляторные элементы, необходимые для репликации: ориджин и может иметь терминатор. Геном прокариот составляет единственный репликон. Полигенный контроль реплиации. Б. Альбертс и А. Корнберг высказали в начале 70-х годов предположение о том, что редупликацию ДНК осуществляет комплекс белков - реплисома, аналогичный рибосоме. По-видимому, кроме ДНК-полимераз и уже перечисленных факторов в состав реплисомы, формирующейся в репликационной вилке, входят и другие белки, прямо или косвенно участвующие в синтезе ДНК. В реплисому, по-видимому, включаются продукты генов dnaB и dnaC, необходимые в течение всей редупликации. Продукт гена dnaB Е. coli оказался ферментом, катализирующим ДНК-зависимый гидролиз рибонуклеозидтрифосфатов до рибонуклеозиддифосфатов и фосфата. Эту активность примерно в 20 раз стимулирует добавление молекул ДНК. Роль продукта dnaB в редупликации пока не установлена. Продукт dnaG необходим для инициации синтеза новых фрагментов Оказаки. Существенным компонентом реплисомы может быть также белок, связывающий ДНК, который обнаружен у ряда объектов - прокариот и эукариот. Белок стимулирует редупликацию и рекомбинацию. Видимо, в ходе редупликации он облегчает разделение комплементарных цепей ДНК. Компонентами реплисомы являются также ферменты, названные топоизомеразами. Их функция — изменение степени суперспирализации ДНК и последующего соединения разорванных концов. Наконец, найдено несколько ферментов, которые плавят ДНК (разделяют комплементарные цепи) за счет использования энергии гидролиза АТФ, например продукт гена rep Е. coli. Итак, в репликационной вилке происходит множество событий: раскручивание ДНК, разделение ее комплементарных цепей, синтез затравочного фрагмента РНК с последующим образованием фрагмента Оказаки, удаление РНК-затравки, заполнение образовавшегося односпирального пробела и ковалентное соединение фрагментов Оказаки. Рестрикция и модификация ДНК (от позднелат. restrictio-ограничение и modificatio- видоизменение), специфич. р-ции метаболизма ДНК в клетках бактерий, обеспечивающие защиту собственной ДНК от встраивания в нее последовательностей ДНК чужеродного происхождения. Функционирование систем Р. и м. ДНК (сокращенно Р.) основано на след. принципах. С помощью ферментативных р-ций собств. клеточная ДНК специфич. образом модифицируется так, что рестриктазы оказываются по отношению к этой ДНК неактивными. Любая вторгающаяся в клетку чужеродная ДНК отличается от резидентной (собственной) ДНК по специфичности модификации. Это делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестриктаз; разрушению ("рестрикции") подвергаются те молекулы ДНК, к-рые не содержат соответствующих модифицир. элементов. Таким образом., благодаря системе Р. возможность функционирования чужеродной ДНК в клетке и ее рекомбинации с собств. клеточной ДНК (см. Рекомбинация генетическая)сведены к минимуму. Известно неск. бактериальных систем Р. Наиб. хорошо изучены аллельные системы К и В (разл. структурные состояния гена), определяющие специфичность резидентной ДНК у штаммов Escherichia coli (E. coli), а также неаллель-ные системы RI и RII, генетич. информацию для к-рых несут плазмиды. Подобные системы в клетках животных пока не обнаружены. В большинстве систем модификация осуществляется метилированием N6-аминогруппы остатков аденина в составе тех или иных специфич. участков ДНК с образованием 6-метиламинопурина. Возможны и др. варианты хим. модификации ДНК, осуществляемой компонентами подобных систем. Напр., в системе EcoRII метилируется атом С-5 остатков цитозина, а при контролируемой клеткой-хозяином модификации ДНК Т-четных фагов (инфицируют Е. coli) происходит глюкозилирование остатков гидроксиме-тилцитозина, присутствующего в ДНК этих фагов. Ф-ции рестрикции обусловлены эндонуклеазной активностью рестриктаз, к-рые узнают специфич. последовательности ДНК при условии, что эти последовательности не модифицированы. Фермент катализирует разрыв фосфодиэфирной связи в каждой из двух цепей ДНК вблизи этой последовательности или в др. местах молекулы, что определяется типом фермента. Двухцепочечные разрывы стимулируют дальнейшее интенсивное неспецифич. разрушение ДНК др. нуклеазами. Р. осуществляются только в отношении двухцепочечных молекул ДНК. Одноцепочечные ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК; образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цепи. В. Арбер доказал, что в бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично отличать свою ДНК от чужой. Эти ферменты рестрицируют (т.е. ограничивают) возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее более или менее специфичной деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции или рестриктазами. Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. ДНК в сайтах рестрикции у самой бактерии модифицирована метилированием, так что фермент рестрикции не может порезать свою собственную ДНК. Однако вирусная ДНК не защищена, и ферменты ее расщепляют.Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочечную ДНК в строго определенных сайтах, была выделена Г. Смитом Известны три класса рестриктаз. В генно-инженерных работах используют ферменты второго класса, разрывающие двухцепочечную ДНК в зоне участка узнавания. Обычно фермент распознает специфичную последовательность из 4-6 п.н., являющуюся палиндромом разрезает ее в середине или несколько в стороне. В последнем случае образуются выступающие одноцепочечные концы, получившие название "липких". Такие концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы могут гибридизоваться между собой в силу комплементарности оснований. Эта способность обеспечивает возможность объединения различных молекул ДНК. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК в общей сложности по почти 120 различающимся последовательностям.