Объекты исследования

В этом номере мы закончили публикацию Бесед Учителя, начатую в 1999 году. Значимость этих текстов для любого человека, вступившего на путь, невозможно переоценить.

Мы надеемся, что Вам, дорогой читатель, они глубоко западут в душу и будут всегда с Вами, чтобы помогать в сложных жизненных ситуациях, в делах обычного дня.

ОБЪЕКТЫ и методы

Объекты исследования

Объектами исследования в данной работе являлись 39 штаммов стафилококков, выделенных со слизистой носа 26 пациентов с такими заболеваниями ЛОР – органов, как синусит (17 человек), ринит (7 человек) и фарингит (2 человека).

Таксоно­мическая характеристика исследуемых видов следующая:

царство Procaryotae

отдел Firmicutes

класс Firmibacteria

семейство Micrococcaceae

род Staphylococcus

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение микроорганизмов

Выделение микроорганизмов проводили на двух питательных дифференциально-диагностических средах. Для исследования микрофлоры использовали желточно-солевой агар (ЖСА) и кровяной агар (КА). В качестве основы ЖСА использовали элективный солевой агар. По прописи готовили 1,8-2% агар, рН 7,2-7,4. К расплавленному и охлажденному до 45-50°С агару, соблюдая правила асептики, добавляли 20% щелочной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывали с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия), смешивали тщательно агар с желточной взвесью, разливали по 20 мл в чашки Петри.

В качестве основы КА использовали сухой питательный агар. Готовили 2% агар, рН 7,4-7,6. К расплавленному и охлажденному до 45° С агару добавляли 5% (5 мл крови на 100мл питательной среды) дефибринированной крови человека. Смесь тщательно перемешивали, чтобы не образовалось пены, и разливали в стерильные чашки Петри.

Исследуемый материал забирали со слизистой носа обследуемых с помощью стерильного тампона. Посев с тампона производили на чашку Петри со средой с целью получения изолированных колоний.

Засеянные среды инкубировали в термостате при температуре 37° С в течение 48 часов. С каждой чашки брали не более трех колоний с определенными признаками: с КА с гемолизирующими свойствами или без гемолиза, с ЖСА с лецитиназной активностью или без нее. Для исследований брали колонии только желтоватого или молочного цвета, поскольку это свидетельствует о принадлежности к роду Staphylococcus. Также для дальнейшего изучения брали колонии, количество которых превышало или было равно 10 ⁴ – 10⁶ КОЕ/мл.

Выросшие изоляты пересевали на скошенный мясопептонный агар и питательный полужидкий агар (0,4%) для получения чистых культур и изучения признаков, используемых при идентификации. О чистоте культуры судили с помощью визуального и микроскопического контроля.

При микроскопировании нативного материала использовали окраску по Граму. Выросшие колонии изолировали в чистую культуру для дальнейшей идентификации.

2.2.2.Идентификация микроорганизмов рода Staphylococcus

Для видового определения представителей рода Staphylococcus использовали следующие тесты: каталазную активность, коагулазную активность в отношении лазмы кролика, образование кислот из маннита, мальтозы, сахарозы, лактозы и глюкозы в анаэробных условиях, наличие уреазы и образование ацетилметилкарбинола.

Для определения каталазной активности микроорганизмов рода Staphylococcus брали суточные культуры стерильной стеклянной палочкой и суспендировали в капле 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствовало о наличии в клетках каталазы. Это отличительное свойство семейства Micrococcaceae от Streptococcaceae.

Реакцию плазмокоагуляции с плазмой кролика ставили следующим образом: 0,5 мл свежей, разведенной физиологическим раствором 1:5 цитратной плазмы кролика вносили в стерильную пробирку и в ней суспендировали одну петлю 18-20 часовой культуры стафилококка. Штатив с пробирками помещали в термостат с температурой 37С и через 1, 2, 4 часа проверяли наличие свертывания плазмы. Если к этому сроку реакция не наступала, то продолжали инкубацию при комнатной температуре с окончательным учетом результата через 18-24 часа.

Для определения окисления углеводов до кислоты делали посевы на среды Гисса с соответствующими углеводами (сахароза, мальтоза, лактоза, манит и глюкоза). Положительная реакция при посеве на глюкозу в анаэробных условиях свидетельствует о принадлежности микроорганизма к роду Staphylococcus, в отличие от рода Micrococcus, который такой способностью не обладает. Результаты учитывали через 24 часа инкубирования, по изменению окраски индикатора. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма с помощью бактериологической петли сеяли в столбик среды уколом.

Для определения наличия уреазы использовали бумажные диски, пропитанные соответствующим реактивом. Для этого в пробирку со стерильным физиологическим раствором объемом 0,3 мл добавляли диск, а затем культивировали 24 часа при 37˚С. Учет результатов проводили по изменению окраски диска: розовый цвет свидетельствовал о положительной реакции.

При определении ацетилметилкарбинола (ацетоина) использовали глюкозо - фосфатный бульон (бульон Кларка). В пробирку с 2,5 мл среды засевали суточную культуру и культивировали 24 часа при 37ºС. Затем добавляли 1 мл спиртового раствора α- нафтола и 0,4 мл 40% KOH, встряхивали пробирку для лучшего доступа кислорода. Положительная реакция оценивается через 10 – 15 минут по красному кольцу на поверхности среды.

2.2.3.Антибиотикограмма исследуемых штаммов

Исследована чувствительность у 39 штаммов бактерий вида S.aureus, S.intermedius, S.delphini, S.epidermidis, S.warneri, S.haemolyticus и S.saprophyticus к 15 антибиотикам (оксациллин, цефазолин, цефалексин, гентамицин, эритромицин, линкомицин, рифампицин, ципрофлоксацин, ванкомицин, ломефлоксацин, нефлоксацин, азитромицин, кларитромицин, офлоксацин, доксициклин). [Приложение 1]

В стерильные чашки Петри разливали по 20 мл расплавленной агаризованной питательной АГВ среды с рН 7,1 – 7,3. Для получения равномерного бактериального газона в чашки с застывшим агаром наливали 1 мл двухмиллиардной суспензии культуры. Затем равномерно распределяли испытываемую культуру по поверхности агара стерильным шпателем. На поверхность засеянного агара пинцетом помещали по одному бумажному диску с каждым антибиотиком

Первая чашка служила для испытания действия семи антибиотиков, вторая - восьми. Диски раскладывали на ровном расстоянии один от другого на расстоянии 2 см от края чашки. На дне чашки отмечали название антибиотика, которым пропитан диск.

Чашки выдерживали при комнатной температуре в течение одного часа, а затем помещали в термостат на 16 – 18 часов. Чтобы избежать размывания зон конденсированной водой, чашки ставили в термостат в перевернутом состоянии.

Интерпретировали значения диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. [Приложение 2]

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Нами было проведено бактериологическое исследование материала, взятого со слизистой носа у 26 больных со следующими ЛОР – заболеваниями: ринит (17 человек), синусит (7 человек) и фарингит (2 человека) и проведено исследование чувствительности к антибиотикам у всех штаммов выделенных видов. Было выделено 39 штаммов стафилококков, идентифицированных как S.aureus, S.intermedius, S.delphini, S.epidermidis, S.warneri, S.haemolyticus и S.saprophyticus. При рините были выделены S.aureus (3 штамма), S.intermedius (1 штамм), S.delphini (1 штамм), S.epidermidis (5 штаммов), S.warneri (4 штамма), S.haemolyticus (9 штаммов) и S.saprophyticus (1 штамм). При синусите были выделены следующие виды: S.aureus (6 штаммов), S.epidermidis (4 штамма) и S.warneri (3 штамма). При фарингите идентифицировали виды S.intermedius (1 штамм) и S.epidermidis (1 штамм).

Первоначальный этап идентификации основывался на изучении мазков, окрашенных по Граму. Штаммы, окрашенные положительно и имеющие характерную кокковую форму, тестировались на наличие каталазы. Микроорганизмы, продуцирующие каталазу, были отнесены к роду Staphylococcus.

Для видового определения и определения патогенности стафилококков использовался тест на коагулазную активность в отношении кроличьей плазмы. Степень и сроки коагуляции плазмы - один из основных признаков патогенных стафилококков. Плазму коагулируют виды S. aureus, S.delphyni и S.intermedius, у остальных данный фактор патогенности отсутствует.

При определении видовой принадлежности каталазопозитивных штаммов стафилококков использовали их биохимические свойства, в частности, способность утилизировать сахара. Основываясь на этом, исследуемые культуры отсевали на среды Гисса. Положительная реакция оценивалась при изменении окраски индикатора. Сахарозу ферментируют S.aureus, S.intermedius, S.delphini, S.epidermidis, S.warneri и S.haemolyticus. Маннит в качестве субстрата использует S.aureus и S.delphyni. Не использует вид S. epidermidis. Вариабельный характер – у S.haemolyticus. Мальтозу ферментируют S.aureus, S.epidermidis, S.warneri и S.haemolyticus. Вариабельный характер в отношении мальтозы проявляет S.intermedius. Лактозу окисляют S.aureus и S.delphini. Вариабельный характер в отношении лактозы проявляют S.intermedius, S.epidermidis и S.haemolyticus. Уреазу продуцируют следующие виды: S.aureus, S.intermedius, S.delphini, S.epidermidis и S.warneri.

Для видовой идентификации, как один из признаков, использовали образование ацетоина (ацетилметилкарбинола). Положительная реакция характерна для S.aureus, S. epidermidis и S.warneri. Отрицательная – для S.intermedius и S.delphyni. Вариабельный характер проявляет вид S.haemolyticus. (Таблица 1)

Таблица 1

Основные дифференцирующие признаки микроорганизмов рода Staphylococcus

Вид   Признак	Катала- за	Коагу-лаза	Саха-роза	Ман- нит	Маль- тоза	Лак- тоза	Уре -аза	Образование ацетоина
S.aureus	+	+	+	+	+	+	+	+
S.intermedius	+	+	+	В	В	В	+	-
S.delphini	+	+	+	+		+	+	-
S.epidermidis	+	-	+	-	+	В	+	+
S.warneri	+	-	+	В	+		+	+
S.haemolyticus	+	-	+	В	+	В	-	В

Примечание:

(+) – тест положительный

(-) - тест отрицательный

(В) – тест вариабельный

При исследовании видового состава стафилококков на слизистой носа при рините у 67% больных выделялись в монокультуре следующие виды: S.aureus (11, 8%), S.haemolyticus (35, 3%), S.warneri (5, 9%) и S.epidermidis (11,8%). Данные литературы о рините подтверждают возможность выделения стафилококков в монокультуре. При синусите у 42,9% больных в монокультуре был выделен только вид S.aureus (42,9%). При фарингите стафилококки выделялись только в монокультуре и распределение по видам следующее: S.epidermidis (50%) и S.intermedius (50%). Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Виды стафилококков, выделенные со слизистой носа в монокультуре

Заболевание Виды	Ринит N=17	Синусит N=7	Фарингит N=2
Abs	%	Abs	%	Abs	%
S.aureus		11.8		42.9	-	-
S.haemolyticus		35.3	-	-	-	-
S.warneri		5.9	-	-	-	-
S.epidermidis		11.8	-	-
S.intermedius	-	-	-	-

У 33% больных при рините были выделены ассоциации стафилококков. В основном ассоциации представляли собой двухкомпонентные и при данном заболевании такой вид ассоциаций был преобладающим, и только у одного больного она была трехкомпонентной. При синусите у 57,2% больных виды стафилококков были выделены в ассоциациях. У двух больных они были двухкомпонентные и у двух – трехкомпонентные. При фарингите ассоциации выделены не были. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Виды стафилококков, выделенные со слизистой носа в ассоциациях

Заболевание Вид	Ринит N=17	Синусит N=7	Фарингит N=2
Abs	%	Abs	%	Abs	%
S.haemolyticus + S.epidermidis		5,9	-	-	-	-
S.epidermidis + S.warneri		5,9		14,3	-	-
S.haemolyticus + S.warneri		11,8	-	-	-	-
S.aureus + S.epidermidis		5,9		14,3	-	-
S.delphini + S.intermedius + S.saprophyticus		5,9	-	-	-	-
S.aureus + S.epidermidis + S.warneri	-	-		28,6	-	-

При исследовании антибиотикорезистентности микроорганизмов рода Staphylococcus к 15 антибиотикам различных семейств были получены следующие результаты.

Все выделенные штаммы S.intermedius (1 штамм), S.delphyni (1 штамм) и S.saprophyticus (1 штамм) были чувствительны к испытуемым антибиотикам.

Все выделенные штаммы S.aureus (9 штаммов) были чувствительны к следующим антибиотикам: цефалексин, линкомицин, рифампицин, ципрофлоксацин, доксициклин. Наибольшее количество штаммов золотистого стафилококка (33%) устойчивы к таким антибиотикам, как оксациллин, гентамицин, эритромицин, азитромицин. 22% штаммов устойчивы к цефазолину, пефлоксацину, кларитромицину, офлоксацину. 11% штаммов были устойчивы к ванкомицину, ломефлоксацину.

Все выделенные штаммы вида S.haemolyticus (9 штаммов) были чувствительны к таким антибиотикам, как цефазолин, цефалексин, гентамицин. Наибольшее количество штаммов S.haemolyticus (44%) устойчивы к линкомицину. 33% штаммов данного вида устойчивы к оксациллину, рифампицину, азитромицину. 22% штаммов устойчивы к ципрфлоксацину, ванкомицину, пефлоксацину, кларитромицину, доксициклину.11% штаммов устойчивы к эритромицину, ломефлоксацину, офлоксацину.

Все выделенные штаммы S.warneri (8 штаммов) были чувствительны к рифампицину, пефлоксацину, офлоксацину. 38% штаммов данного вида устойчивы к цефалексину, гентамицину. 25% штаммов штаммов S.warneri устойчивы к доксициклину. 13% штаммов устойчивы к оксациллину, цефазелину, эритромицину, линкомицину, ципрофлоксацину, ванкомицину, ломефлоксацину, азитромицину, кларитромицину.

Все выделенные штаммы S.epidermidis (5 штаммов) были чувствительны к ципрфлоксацину, цефалексину. 10% штаммов устойчивы к оксациллину, цефазолину, пефлоксацину. 20% штаммов устойчивы к гентамицину, рифампицину, ломефлоксацину, азитромицину, офлоксацину. 40% штаммов этого вида устойчивы к эритромицину, линкомицину, ванкомицину, кларитромицину, доксициклину.

Определенной закономерности в распространении антибиотикорезистентности среди выделенных штаммов стафилококков не обнаружено. Предположительно, это связано с тем, что данные заболевания протекают в хронической форме с периодическими обострениями, и пациенты при лечении не отдают предпочтение каким – то определенным семействам антибиотиков. Данные представлены в таблице 4.

Антибио тик Вид	Оксацил лин	Цефазо лин	Цефалек син	Гентами цин	Эритро мицин	Линко мицин	Рифам пицин	Ципрофлок сацин	Ванкоми цин	Ломефлок сацин	Нефлокса цин	Азитро мицин	Кларитромицин	Офлоксацин	Доксициклин
S.aureus N=9	33%	22%	0%	33%	33%	0%	0%	0%	11%	11%	22%	33%	22%	22%	0%
S.intermedius N=1	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
S.delphini N=1	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
S.haemolyticus N=9	33%	0%	0%	0%	11%	44%	33%	22%	22%	11%	22%	33%	22%	11%	22%
S.warneri N=8	13%	13%	38%	38%	13%	13%	0%	13%	13%	13%	0%	13%	13%	0%	25%
S.epidermidis N=5	10%	10%	0%	20%	40%	40%	20%	0%	40%	20%	10%	20%	40%	20%	40%
S.saprophyticus N=1	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%

Таблица 4

Антибиотикорезистентность выделенных штаммов стафилококков, (%)

ВЫВОДЫ

На основании полученных данных были сделаны следующие выводы:

1. При исследовании видового состава у лиц с различными ЛОР-патологиями были получены следующие результаты. При рините были выделены штаммы S.aureus, S.intermedius, S.delphini, S.saprophyticus, S.epidermidis, S.warneri и S.haemolyticus. При синусите были выделены штаммы S.aureus, S.epidermidis и S.warneri. При фарингите идентифицировали виды S.intermedius и S.epidermidis.

2. У 67% больных ринитом в монокультуре выделялись следующие виды стафилококков: S.aureus, S.haemolyticus, S.warneri и S.epidermidis. При синусите у 42,9% больных в монокультуре был выделен только вид S.aureus. При фарингите стафилококки S.epidermidis и S.intermedius выделялись только в монокультуре. При рините было выделено наибольшее количество ассоциаций, отличающихся наибольшим видовым разнообразием.

3. При исследовании антибиотикорезистентности выделенных штаммов стафилококков определенной закономерности в распределении устойчивости по семействам антибиотиков выделено не было.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акатов А.К., Бароян О.В. Стафилококк и стафилококковая инфекция.-Саратов, 1988.

2. Бабич Е.М., Елисеева И.В., Белозерский В.И., Кременчуцкий Г.И. Микробные ценозы носоглотки// Микробиологический журнал.-1999.-№3.-С.63-69.

3. Бухарин О.В. Персистенция бактериальных паразитов как результат отношений паразит-хозяин// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1997.-№4.- С.3-10.

4. Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б., Райцелис И.В., Забиров Р.А. Связь биологических свойств стафилококка с течение гнойных синуситов// Вестник оториноларингологии.-1998.-№5.-С.35-37.

5. Выгодчиков Г.В. Стафилококковые инфекции.- Москва, 1963.

6. Гудима И.А., Васильева Л.И., Брагина Л.Е., Сучков И.Ю. Вирусо-бактериально-грибковые ассоциации при хроническом тонзиллите у детей// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2001.-№5.-С.16-19.

7. Иванов Н.Р. Стафилококковая инфекция.- Саратов, 1975.

8. Касымов К.Т. Иммунологическая толерантность в патогенезе “злостного” носительства патогенных стафилококков// Лабораторное дело.-1982.-№5.-С.300-303.

9. Марушко Ю.В., Кигель Н.Ф., Рожанская А.М., Жолобак Н.М. Изучение микробного ценоза миндалин у здоровых и часто болеющих детей// Микробиологический журнал.-1999.-№2.-С.74 –80.

10. Медицинская микробиология. Эффективная система изучения материала./Под ред. Поздеева О.К. – М.: Медицина, 1999.

11. Миронов А.Ю., Савицкая К.И., Воробьев А.А. Условно патогенные микроорганизмы при гнойно – воспалительных заболеваниях ЛОР – органов и менингитах// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2001.-№2.-С.21-25.

12. Пальчун В.Г., Полякова Т.С.,Романова О.Н. Лечебно – диагностический подход к проблеме хронического тонзиллита// Вестник оториноларингологии.-2001.-№1.-С.30-33.

13. Паршута Л.И., Усвяцов Б.Я. Роль факторов персистенции в формировании микробного биоценоза слизистой носа у стафилококковых бактерионосителей// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1998.-№1.-С.17-21.

14. Позняк А.Л., Лобзин Ю.В., Сидорчук С.Н. Хламидийные поражения дыхательных путей// Эпидемиология и инфекционные болезни.-2002.-№5.-С.46-53.

15. Полякова Т.С., Коршунов В.М. Исследование аэробного микробного фона и антибиотикочувствительности выделенных штаммов в отоларингологическом отделении// Вестник оториноларингологии.-1998.-№5.-С.35-37.

16. Полякова Т.С., Челядинова Е.В. Полипозный риносинусит// Вестник оториноларингологии.-1998.-№2.-С.52-56.

17. Протасевич Г.С., Яшан И.А., Яшан А.И. Аденоиды у взрослых// Вестник оториноларингологии.-1999.-№5.-С.11-15.

18. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология.- М.: Медицина, 1980.

19. Рязанцев С.В., Хмельницкая Н.М., Тырнова Н.В. Роль слизистой оболочки в защите ЛОР – органов от потенциальных патогенных для организма антигенных факторов// Вестник оториноларингологии.-2000.-№3.-С.60-63.

20. Смирнова А. М., Трояшкин А. А., Падерина Е. М. Микробиология и профилактика стафилококковых инфекций. – Л.: 1977.

21. Смирнов В.В., Вершигора А.Е. Стафилококк.- Киев, 1988.

22. Стафилококковые инфекции. Особенности клиники, диагностики, профилактики и лечения. Под. ред. Диковой А.А.- Горький, 1980.

23. Тарасов А.А., Каманин Е.И., Крюков Л.И., Страчунский Л.С. Острый бактериальный риносинусит// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2002.- №1.- С.70-82.

24. Усвяцов Б.Я., Паршута Л.И., Бухарин О.В. Характеристика микробного биоценоза слизистой носа у здоровых людей и стафилококковых бактерионосителей// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2002.-№6.-С.65-69.

25. Федоровская Е.А., Немировская Л.И. Взаимосвязь микробных экосистем и иммунитета человека// Микробиологический журнал.-1999.-№5.-С.85-95.

26. Goldmann D.A. Bacterial colonization and infection in the neonate//Am J. Med., 1981.-70.- p.417-22.

27. Bergey`s manual of determinative bacteriology. 9^th ed.- Baltimor: Williams & Wilkins; 1994.

28. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H. Manual of clinical microbiology. 6^th ed. Washington, D.C.: ASM Press; 1995.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

Принадлежность антибиотиков к семействам

Семейство	Представитель
Пенициллины	Оксацилин
Цефалоспорины	Цефазолин, цефалексин
Гликопептиды	Ванкомицин
Аминогликозиды	Гентамицин
Макролипиды и линкосомиды	Линкомицин, эритромицин, азитромицин, кларитромицин
Рифампицины	Рифампицин
Фторхинолоны	Ципрофлоксацин, ломефлоксацин, пефлоксацин, офлоксацин
Тетрациклины	Доксициклин

Приложение 2

Значение диаметров зон задержки роста бактерий.