Методики культивирования одиночных растительных клеток

Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию.

Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.

Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Этого можно достичь путем обработки ткани пектиназами, что ведет к мацерации ее клеток. Однако не всегда после такой обработки клетки сохраняют способность к последующим делениям и образованию ткани. Лучше получать отдельные клетки из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.

Далее клетки изолируют либо при помощи микроманипуляторов, либо путем ряда последовательных разведений. При первых же попытках культивирования отдельных клеток возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей? Отдельные клетки вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.

При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество, стимулирующее деление отдельных клеток. Определено, что этот фактор имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен (М.К. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1965), видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны, синергичен с брассиностероидами. Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.

Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки» (рис. 12).

Рис. 12. Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.

Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению.

Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. В 1959 году Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3 * 0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.

Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).

Все эти способы культивирования позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования. Он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался в больших объемах питательной среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.

Раздел "Генная инженерия"