Дослід 2. Визначення процесів ліпідної пероксидаціі в тканинах. Визначення вмісту малонового діальдегіду

Принцип методу. Метод ґрунтується на тому, що за високої температури в кислому середовищі малоновий діальдегід (МДА) реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) з утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання при 532 нм.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, фосфатний буфер рН 7,4; 1мМ KMnO₄, 1 мМ FeSO₄, 20 % розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК), 1н хлоридна кислота, 0,7 % тіобарбітурова кислота, бутанол, центрифуга, водяна баня, спектрофотометр, пробірки.

Хід роботи. До 3 мл фосфатного буфера (рН 7,4) додають 0,2 мл сироватки; 0,5 мл 1мМ KMnO₄, перемішують, а через 10 хв додають 0,5 мл 1 мM FeSO_4. Після цього додають 1 мл 20 % ТХАК і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. Далі до 2 мл супернатанту додають 0,5 мл 1н НСІ та 1 мл 0,7 % тіобарбітурової кислоти. Суміш витримують 20 хв на киплячій водяній бані (95-100°С). Після різкого охолодження в пробірку вносять 3 мл бутанолу, ретельно перемішують розчин і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв.

Оптичну густину розчину визначають спектрофотометрично при 532 нм. Вміст МДА виражають в мкМ/мл сироватки.

Розрахунок проводять за формулою:

С = А × 52,88 / 0,2,

де А – оптична густина розчину;

52,88 – коефіцієнт перерахунку;

0,2 – кількість мл сироватки крові в пробі.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Утворення вільних радикалів та продуктів ПОЛ є необхідною ланкою нормального метаболізму, що корелює з активністю мембранозв’язаних електронтранспортних та енерго-трансформуючих систем, сприяє оновленню клітинних мембран, бере участь у регуляції активності мембранозв’язаних ферментів, біосинтезі простагландинів, лейкотрієнів, піноцитозі.

Вміст МДА (ТБК-активних продуктів) у крові здорових людей становить 6,2-8,3 мкмоль/л. Надмірна інтенсифікація ПОЛ призводить до порушення перебігу хімічних процесів, клітин і наростання системної поліорганної патології. Збільшення вмісту МДА спостерігається при атеросклерозі, ішемічній хворобі серця та печінки, гіпертонічній хворобі, під впливом іонізуючого опромінення, а також під час старіння. Зниження вмісту МДА спостерігається при хронічній серцевій недостатності, онкологічних захворюваннях, тощо.