Плазміди агробактерій як вектори для трансформації

Унікальні біологічні властивості Ті-плазміди роблять її ідеальним вектором для перенесення генів. Вона має широке коло господарів, вбудовує ДНК до складу хромосоми, де вона реплікується і більша її частина транслюється з утворенням білка. Однак із-за великих розмірів (від 200 до 800 кб) маніпуляції з Ті-плазмідою ускладнені, вставити ген в плазміду традиційними методами стає неможливим.

Незважаючи на це сконструйовано декілька векторів для рослинних клітин. Усі вектори на основі Ті-плазмід організовані подібно і мають такі елементи:

- селективний маркерний ген, наприклад, ген неоміцинфосфотрансферази, який забезпечує стійкість трансформованних рослинних клітин до канаміцину,

- сайт ініціації реплікації, який дозволяє плазміді реплікуватися в E.coli,

- права фланкуюча послідовність Т-ДНК, яка необхідна для інтеграції Т-ДНК в клітинну ДНК рослин,

- полілінкер (множинний сайт клонування) для вбудовування гена в ділянку між межами Т-ДНК.

Ці вектори не містять онкогенних послідовностей, а тому після перенесення з їхньою допомогою ДНК в ядро рослинної клітини нормальний ріст рослини не порушується. Але оскільки такі вектори не містять генів vir, то вони самі не здатні забезпечити транспорт та інтеграцію Т-ДНК в клітини рослини-хазяїна. Для вирішення цієї проблеми розроблено два методи.

У першому випадку для введення чужорідної ДНК використовують коінтегративну векторну систему, яка передбачає використання проміжного вектора (Рис. 9).

Спочатку Т-ДНК за допомогою рестриктаз вирізають із плазміди і вставляють у вектор для клонування в E. coli (наприклад, pBR322). Плазміду з Т-ДНК розмножують і, використовуючи стандартні методи, вбудовують чужорідний ген всередину Т-області і знову розмножують з уже вставленим геном. Потім отриману рекомбінантну плазміду вводять в клітини A. tumefaciens, які несуть повну Ті-плазміду. В результаті подвійного кросинговеру (гомологічної рекомбінації) між гомологічними районами Т-ДНК частина рекомбінантної плазміди, яка містить чужорідний ген, включиться в Ті-плазміду, замістивши у ній нормальну Т-ДНК. Нарешті, бактеріями, які мають Ті-плазміду з вбудованими генами, заражають рослини і в результаті отримують клітини корончатого гала, які будуть містити Т-область з вбудованим у неї чужорідним геном.

Другий поширений метод введення чужорідної інформації полягає у використанні бінарної векторної системи. Бінарний вектор містить ініціації реплікації і для E. coli, і для A. tumefaciens, але не містить генів vir. Всі стадії клонування проводять в E. сoli, а потім вектор вводять в A. tumefaciens. Штам-реципієнт A. tumefaciens несе модифіковану неонкогенну (“роззброєну”) Ті-плазміду: вона містить повний набір vir -генів, але з неї видалена частина (або вся) Т-ДНК, так що Т-ДНК не може бути транспортована. В цій системі на неонкогенній Ті-плазміді синтезуються продукти vir -генів. Продукуючи білки, які кодуються vir -генами, неонкогенна Ті-плазміда сприяє вбудовуванню Т-ДНК із бінарного вектора в хромосомну ДНК рослини. Поширений бінарний вектор – рBin19.