Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі

Як вихідний матеріал для виділення протопластів, як правило, використовують інтактні листки або калюсні і суспензійні культури. Виділення протопластів проводять за методом фільтрації–центрифугування (Рис. 5).

Виділення протопластів із мезофілу листка

Для виділення мезофільних протопластів використовують рослини певного віку, наприклад, при отриманні протопластів із листків тютюну беруть 50 – 60

Рис. 5. Етапи виділення і культивування протопластів.

добові рослини, із листків бобів – 14 – 18 добові. Ферментні розчини готуються безпосередньо перед використанням і стерилізуються через бактеріальний фільтр (1 % Cellulysin – целюлаза, 0,5 % Macerozyme – пектиназа).

1. Листки нарізають тонкими смужками (менше 1 мм) і кладуть на поверхню ферментного розчину. Ферментацію проводять у чашках Петрі або у колбочках об’ємом 50 мл. Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.

2. Тотальний препарат протопластів після інкубації у ферментному розчині фільтрують через нейлонову сітку (розмір пор – 50 – 100 мкм), щоб позбутися шматочків тканини і елементів провідної системи.

3. На поверхню ферментного розчину акуратно нашаровують сольове середовище W-5, до складу якого входять NaCl, CaCl₂, KCl і глюкоза.

4. Суспензію протопластів центрифугують при 100g 2 – 3 хв.

5. Протопласти, які флотували на межі ферментного розчину і середовища W-5, акуратно відбирають пастерівською піпеткою і переносять у центрифужну пробірку, у яку до 1 мл суспензії протопластів додають 8 – 10 мл сольового середовища W-5 і центрифугують при 80 – 100 g 3 хв.

6. Осад протопластів двічі відмивають у середовищі W-5 центрифугуванням.

Виділення протопластів із культури клітин

Оскільки клітини у суспензійній культурі мають потовщену клітинну стінку, що ускладнює її гідроліз ферментами і тому зменшується вихід протопластів, то для підвищення цього показника (виходу ізольованих протопластів) рекомендують пересаджувати клітинну суспензію на свіже живильне середовище кожні 2 – 3 доби.

Для виділення протопластів із суспензії її спочатку фільтрують, а потім клітини суспендують у ферментному розчині або змішують суспензію із ферментом у співвідношенні 1:1. Ферментна суміш: 1,5 % Onozuka (целюлаза), 0,5 % Macerozyme (пектиназа) і 0,2 % Cellulysin.

Суспензію рекомендують інкубувати на шейкері. Температуру і час необхідно підбирати індивідуально для кожного об’єкта.

Подальші операції аналогічні тим, які проводять при виділенні мезофільних протопластів.