Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин

Ідея про можливість культивування клітин поза організмом – in vitro – була висловлена стосовно клітин рослин. Однак вперше в культуру було введено клітини тварин. Дослідникам довго не вдавалося культивувати рослинні клітини на штучних живильних середовищах. Перших успіхів у цій області досягли у 30^-х роках ХХ століття, а бурхливого розвитку новий напрямок досліджень набув у 60 – 70^-х роках того ж століття. В історії розвитку цього методу можна виділити декілька періодів.

Період з 1892 по 1902 – перші роботи в області розвитку методу культури ізольованих тканин рослин. Цей період пов’язаний з іменами трьох видатних німецьких вчених: Х. Фьохтінга, К. Рехінгера та Г. Габерландта. Не отримавши експериментальних успіхів, ці дослідники висунули ряд ідей та гіпотез, які були реалізовані значно пізніше.

Х. Фьохтінг, вивчаючи явище полярності у рослин, пробував вирощувати in vitro невеличкі шматочки рослинних тканин. Він показав, що полярність властива навіть самим маленьким фрагментам тканини і припустив, що вона є властивістю самої рослинної клітини.

К. Рехінгер поміщав сегменти стебла тополі, шматочки кореня буряка і кульбаби на вологу поверхню фільтра і спостерігав процес калюсоутворення. Зменшуючи розмір експлантата, він визначив мінімальний розмір фрагмента, здатного утворювати калюс.

Г. Габерландт вперше висловив ідею про можливість культивування in vitro ізольованих клітин рослин та запропонував гіпотезу про тотипотентність будь-якої живої рослинної клітини. Однак його власні спроби культивувати на штучному живильному середовищі групи клітин палісадної паренхіми листка, епідерму традесканції були невдалими. Розрахунок Г. Габерландта на те, що хлорофілоносні клітини паренхіми забезпечать себе органічними речовинами за рахунок фотосинтезу був помилковим. Повністю диференційовані тканини, клітини яких втратили ембріональну активність, не росли і не давали новоутворень in vitro, а способу їх дедиференціації Г. Габерландт не знайшов, фітогормони у той час ще були невідомі.

Період з 1902 по 1922 роки характеризується багаточисельними спробами підібрати оптимальне живильне середовище і умови сприятливі для культивування in vitro ізольованих органів, тканин і клітин рослин.

У цей період були отримані перші результати по культивуванню тканин тварин на живильних середовищах з додаванням сивороток. Однак спроби виростити ізольовані тканини рослин на середовищах з додаванням екстрактів рослинних тканин були невдалими. Помилкою всіх цих досліджень було те, що всі вчені використовували високо спеціалізовані рослинні тканини. Саме вдалий вибір об’єкту визначив успіхи В. Робінса і Котте, які у 1922 році одночасно і незалежно один від одного показали можливість культивування на штучному живильному середовищі меристеми кінчика кореня томатів та кукурудзи. Ці досліди можна вважати початком застосування методу культури ізольованих органів рослин.

Період з 1932 по 1939 роки починається з робіт американського дослідника Ф.Уайта та французького Р.Готре. Успіх цих дослідників обумовили вдалий вибір об’єктів дослідження і ретельний підбір складу живильного середовища для культивування. Вони повторили дослід В.Роббінса і Котте і показали, що ізольовані корені можуть рости у культурі необмежено довго, якщо їх кінчики періодично пересаджувати на свіже живильне середовище. Здатність до необмеженого росту при субкультивуванні була продемонстрована пізніше цими ж авторами для калюсної тканини камбіального та паренхімного походження, а також для тканин рослинних пухлин. Це відкриття дало новий поштовх у роботі по культурі рослинних тканин.

У період з 1940 по 1960 рр. збільшилась кількість видів рослин, тканини яких вирощували in vitro. Їх список становив 142 види. Тривало пересаджувані культури успішно отримували із різних органів і тканин рослини. Були розроблені склади живильних середовищ, вивчено значення макро- і мікроелементів для підтримання нормальної ростової активності тканини. Виявлена потреба культур у вітамінах і стимуляторах росту. Оцінено значення натуральних екстрактів типу ендосперму кокосового горіха, каштана, кукурудзи та інших рослин для підтримання неорганізованого клітинного росту і стимуляції процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу у культурі калюсних тканин і клітинних суспензій. Саме у роботі з культурою тканин у 1955 році відкрито новий клас фітогормонів – цитокініни і показано їх значення для поділу клітин in vitro та індукції стеблового морфогенезу.

В цей період розроблено метод отримання і вирощування великих мас клітинних суспензій та метод культивування окремої, виділеної із суспензії клітини, поділ якої індукується за допомогою тканини-няньки.

Період з 1960 по 1975 рр. Найважливішою подією цього періоду була розробка Е.К. Кокінгом методу отримання ізольованих протопластів із тканини кореня і плодів томатів шляхом обробки їх сумішшю пектолітичних та целюлітичних ферментів. Пізніше І.Такебе із співробітниками підібрали умови культивування ізольованих протопластів, за яких вони утворюють нову клітинну стінку, діляться і дають початок клітинним лініям, здатним у ряді випадків до морфогенезу. Вперше отримано і вивчено рослини-регенеранти тютюну, які були сомаклональними варіантами вихідної форми.

Одночасно ізольовані протопласти які ще не утворили клітинну стінку, були використані для розробки методів гібридизації соматичних клітин шляхом злиття протопластів з допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ) і введення в них вірусної РНК, клітинних органел, клітин бактерій.

Перші соматичні гібриди були використані як моделі для вивчення поведінки ядерного та цитоплазматичного геномів партнерів у гібридних клітинних лініях і у потомстві соматичних гібридів рослин.

У цей же період французьким вченим Ж.Морелем розроблено метод культури меристем, який дозволяє отримувати безвірусні рослини. За допомогою цього методу оздоровлені рослини розмножуються з високим коефіцієнтом.

Період з 1976 року і до сьогодні – розроблено метод електрозлиття ізольованих протопластів (U.Zimmerman, 1983) і методи селекції гібридних клітин. З використанням ізольованих протопластів і векторів, створених на основі Тi- та Ri– плазмід Agrobacterium tumefaciens і A.rhizogenes розроблено ефективний спосіб перенесення генів для дводольних рослин. Розроблено метод балістичної трансформації або мікробомбардування, який ефективно застосовується і для однодольних рослин.

Методи мутагенезу і клітинної селекції, отримання сомаклональних варіантів застосовують для створення нових форм і сортів сільськогосподарських рослин.

Методи скринінгу біохімічних мутантів привели до появи більш продуктивних і пристосованих до умов культивування клітинних штамів, які використовуються у промисловості.

В Україні експериментальні роботи по культивуванню тканин рослин започатковані 1949 рок в Інституті фізіології рослин АН УРСР. Тут у керованим професором Ф.Л.Калініним відділі росту і розвитку проведено роботи по вивченню фізико-хімічних і біохімічних механізмів пухлинної трансформації рослинних клітин, мікроклональному розмноженню та ін.

Активний розвиток різних напрямків біотехнології рослин припадає на 70-80 роки. У цей період в Інституті ботаніки імені М.Г.Холодного під керівництвом академіка К.М.Ситника проводяться оригінальні роботи з гібридизації протопластів та клітинної селекції.

Сьогодні теоретичні і практичні аспекти біотехнології вирішуються в ряді наукових та вищих навчальних закладів. Серед них – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Інститут картоплярства УААН, Інститут садівництва УААН, Інститут цукрових буряків УААН, Державний Нікітський ботанічний сад та інші. Українськими вченими охоплене широке коло досліджень, які мають вагоме значення для розвитку вітчизняної та світової біотехнології.

ОРГАНІЗАЦІЯ І ОБЛАДНАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ

Культивування рослинних клітин, тканин і органів вимагає дотримання умов стерильності. Ця основна технологічна умова і визначає особливості організації та оснащення лабораторії, де культивують рослинні тканини.

У такій лабораторії мають бути приміщення для проведення наступних операцій:

1) миття і стерилізації посуду;

2) приготування, стерилізації і зберігання живильних середовищ;

3) ізолювання і перевивання культур в асептичних умовах;

4) вирощування культур в термостатованих умовах;

5) біохімічного аналізу матеріалу, кількісного обліку результатів, мікроскопіювання тканин і клітин і т.д., залежно від цілей роботи.

У мийній кімнаті мають бути глибокі раковини з кислотостійкого матеріалу і крани з гарячою і холодною водою, стелажі для сушіння посуду, шафи для зберігання посуду, апарати для дистиляції води та бідистилятори.

Живильні середовища готують в окремій кімнаті, в якій є лабораторні столи, шафи для зберігання реактивів, холодильники для зберігання концентрованих розчинів живильних середовищ, аналітичні, технічні і торсійні ваги, рН-метри, електричні або газові плити, водяні бані, магнітні змішувачі.

Кімната для стерилізації середовищ, інструментів і посуду обладнується автоклавами вертикальними (ВК-60, ВК-75), горизонтальними (ГК-100, АГ-100) і сушильними шафами для стерилізації сухим жаром.

Для проведення робіт в асептичних умовах використовують ламінарний бокс, в який нагнітається стерильне повітря, що проходить через бактеріальні фільтри. Ламінари розміщують в окремій кімнаті. Якщо немає ламінарних боксів, то обладнують спеціальну кімнату-бокс - операційну. Стіни такої кімнати облицьовують кахлем, підлогу застилають лінолеумом. Двері операційної повинні герметично зачинятися і перед ними має бути тамбур (передбоксник). В бокс повинно надходити стерильне кондиціоноване повітря. Бокс оснащують бактерицидними лампами. В операційній кімнаті розміщують покриті легкомиючим матеріалом столи, медичні шафи, бінокулярні мікроскопи, потрібні інструменти, спиртівки.

Ізольовані тканини культивують у термостатованому приміщенні (культуральній) з кондиціонованим повітрям, регульованою температурою (22-28⁰С) і вологістю повітря (70-80%). Регулювання світлового режиму забезпечують за допомогою реле часу.

Лабораторні приміщення оснащують обладнанням, необхідним для біохімічних, гісто- і цитогенетичних та інших досліджень, пов’язаних з основними роботами по вирощуванню рослинних тканин.

Посуд, інструменти і матеріали

Посуд, який використовують при роботі з культурою ізольованих тканин можна розділити на 3 групи:

1. Посуд для приготування і зберігання живильних средовищ: бутлі з темного скла, колби Ерленмейера, колби мірні, колби Бунзена, колби плоскодонні, стакани хімічні, циліндри мірні, піпетки Мора, піпетки градуйовані, часові скельця, лінійки, скляні палички різних розмірів, фільтри Зейтца, скляні та мембранні фільтри.

2. Посуд для вирощування ізольованих тканин: бутлі для культивування клітинних суспензій, колби Ерленмейера, колби Ерленмейера широкогорлі, чашки Петрі різного діаметра, пробірки біологічні, флакони, скельця предметні з ямкою і без ямки, скельця покривні.

3. Посуд, який використовується при пересаджуванні тканин: стакани з кришкою, чашки Петрі, колби Ерленмейера, піпетки, стакани фарфорові для стерилізації інструментів.

Для ізолювання і пересадки тканин на середовища, як правило, використовують скальпелі, пінцети анатомічні, очні пінцети, довгі пінцети з тонкими кінцями, ножиці, пробкові свердла різного діаметра, леза для безпечних бритв і корцанги для їх утримання, металічні петлі, голки анатомічні.

Для роботи з культурою тканин потрібні ряд допоміжних матеріалів: вата, марля, нейлонова тканина, целофан, алюмінієва фольга, обгортковий папір, пергаментний папір, фільтрувальний папір, гумові кільця. Вату використовують для виготовлення пробок, ватних тампонів для піпеток, протирання робочих поверхонь при стерилізації. Марля необхідна для обгортання ватних пробок, фільтрування середовищ, виготовлення мішечків. Для фільтрування клітинних суспензій необхідна нейлонова тканина різноїщільності. Із целофану роблять ковпачки для запобігання середовищ від висихання, які закріпляють гумовими кільцями. Алюмінієвою фольгою зручно закривати культуральні посудини замість ватних пробок. Для загортання посуду при стерилізації в автоклаві потрібний обгортковий або пергаментний папір. На фільтрувальному папері підсушують рослинний матеріал після стерилізації.

Миття посуду

Обов’язковою умовою успішного культивування рослинних тканин є чисто вимитий стерильний посуд. Існує два методи миття посуду: кислотний і лужний.

Самим поширеним і надійним методом підготовки скляного посуду, особливо нового, є кислотний – замочування посуду на 4-6 год у хромовій суміші – розчин біхромату калію в концентрованій сірчаній кислоті. Потім посуд багаторазово промивають теплою проточною водою і ретельно ополіскують дистильованою водою.

Використаний посуд звільняють від залишків середовища і ретельно миють з застосуванням звичайних мийних засобів (лужний метод), і ополіскують дистилятом.

Вимитий посуд сушать і стерилізують сухим жаром у сушильній шафі при температурі 170-180⁰С 1-2 год, закривають целофановими ковпачками і зберігають у металевих біксах і пеналах або шафах, захищених від проникнення пилу.