Способи одержання генетично-модифікованих мікроорганізмів

Як відомо, здатність організмів синтезувати ті чи інші біомолекули, в першу чергу білки, закодовано в їх геномі. Тому достатньо «включити» потрібний ген, взятий із іншого організму, в бактеріальну клітину, яка здатна рости в простих умовах і швидко розмножуватися. Однак, спроби провести перенесення в бактеріальну клітину безпосередньо геномної ДНК призвели до суперечливих результатів. Лише в 70-ті роки одержано результати з застосування так званої векторної трансформації. В основі цього методу – використання векторних молекул – ДНК, що мають здатність переносити гени, які вони містять, у клітину, де ці молекули реплікуються автономно або після інтеграції з геном. Вирішальну роль у цих експериментах відіграли також методи одержання індивідуальних генів, створення їх у необхідній кількості шляхом клонування, тобто практично необмежуваного розмноження в бактеріальних клітинах.

В основі всіх досягнень генетичної інженерії лежить відкриття однієї із властивостей будови геному бактерій – наявності в клітинах невеликих кільцевих молекул ДНК – плазмід, які відрізняються від хромосом. Плазміди широко розповсюджені в природі і зустрічаються в меншій кількості у прокаріотичних організмів, а також у нижчих еукаріот – дріжджів. Важливою властивістю плазмід є їх здатність реплікуватися разом з ДНК клітини-хазяїни, і тому в останній час їх вважають внутрішньоклітинними паразитами, але симбіонтами. Клітини-хазяї не мають потреби в плазмідах для виживання в простих умовах, але часто плазміди надають їм ряд особливих властивостей. Зокрема, плазміди визначають їх здатність до статевого розмноження (F-фактор), стійкість до антибіотиків і дезінфікуючих речовин (R-фактор), можливість засвоєння деяких складних органічних речовин, наприклад, вуглеводів.

Основна частина дослідів, які призвели до розвитку генної інженерії, проводилися на класичному об’єкті – бактеріях Esherichia coli. За допомогою спеціальних ферментів – ендонуклеаз рестрикції, або рестриктаз, плазміда, яка несе який-небуть маркерний ген, наприклад, ген стійкості до певного антибіотику, розрізається в певному місці з кожної сторони декількох (від 1 до 5) неспарених основ – «липких кінців». За допомогою таких же рестриктаз одержують фрагмент геному організму донора, який несе в собі потрібний ген, наприклад, ген людського інсуліну.

На сьогодні донорну ДНК частіше одержують шляхом «пришивання» «липких кінців» до молекули ДНК, одержаної шляхом зворотної транскрипції з матричної РНК потрібного гену (кДНК). Головну роль тут відіграє фермент зворотна транскриптаза, або ревертаза, вперше відкрита у ретровірусах (таких як ВІЛ та деякі збудники злоякісних новоутворень – онковірусів). Однак, за рахунок комплементарної взаємодії неспарених основ «липких кінців» відбувається включення потрібного гена в плазміду, при цьому утворюється нова рекомбінантна (гібридна) ДНК. Завершує процес фермент ДНК-лігаза, який ковалентно зашиває розриви в ланцюгах ДНК.

Наступний етап – перенос рекомбінатної плазміди в бактерію. Такий процес – включення чужорідної ДНК в бактеріальну клітину – має назву трансформації, а молекула ДНК – вектор. Це явище інколи зустрічається в природі та свідчить про те, що трансформація – це природній біологічний процес. У природніх умовах трансформація зустрічається у таких бактерій, як збудник пневмонії Diplococcus pneumonia і Bacillus subtilis. Необхідною умовою трансформації є синтез бактеріями особливого білка компетентності, що відбувається тільки під час активного росту колоній мікроорганізмів. Бактерії з трансформованими плазмідами легко відібрати: вони здатні рости в присутності антибіотика, проти якого в плазміді наявний ген стійкості.

Другий спосіб складання векторних молекул передбачає використання бактеріофагів, які заражають виключно бактерії. Найбільш широкого застосування одержав бактеріофаг λ. Середня частина геному цього вірусу не несе в собі важливих функцій і може бути замінена на чужорідний фрагмент ДНК. В наш час існує досить багато векторів, сконструйованих на основі різноманітних плазмід і бактеріофагів.

Відносно складніше піддаються генетичній модифікації еукаріотичні мікроорганізми, до яких відносять гриби, рослини і тварини. Найбільше значення як для біологічних виробництв, так і для генетичних досліджень мають хлібопекарські дріжджі Saccharommyces cerevisiae. Як і у бактерій, у них наявні плазміди, але використання їх в якості векторів часто вивляється не досить ефективним. Тому для того, щоб виник стабільний трансформант, необхідні два послідовні явища: проникнення рекомбінантної ДНК в клітину та її інтеграція в хромосомну ДНК. Такий метод називається інтегративною трансформацією.

У подальшому генно-інженерне конструювання у дріжджів розвивалося по шляху створення кільцевих плазмід з центромерами, особливими ділянками ДНК, що забезпечують зв'язок з білками веретена поділу і, як наслідок, рівномірний розподіл таких плазмід між двома клітинами під час мітозу. Розвиток цього підходу призвів до створення цілих штучних міні-хромосом, які містять окрім центромерної ділянки, – теломери, загнуті на кінцях у вигляді булавки, і реплікатори – ділянки початку реплікації ДНК. Подібні міні-хромосоми можуть включати одразу декілька корисних генів, що забезпечує виробництво потрібної біотехнологічної продукції.

Контрольні запитання

1. Що таке генетично модифіковані організми?

2. У чому суть генетичної інженерії рослин?

3. Які генетично модифіковані джерела рослинного походження використовують у харчовій промисловості?

4. Яких властивостей набувають генетично модифіковані рослини?

5. Які напрями створення трансгенних сільськогосподарських тварин і птиці? Чим це зумовлено?

6. Які передумови використання біомаси генетично модифікованих мікроорганізмів?

7. Наведіть приклади використання продуктів біосинтезу генетично модифікованих мікроорганізмі у харчових технологіях.