Регуляція експресії генів. Генетичні рекомбінації

8.3.1. Регуляція експресії генів у прокаріотів. Основною умовою існування будь-яких живих організмів є наявність тонкої, гнучкої, узгодженої діє системи регуляції, в якій всі елементи тісно зв’язані один з одним. У білковому синтезі не тільки кількісний та якісний склад білків, але і час синтезу мають велике значення. Від цього залежить пристосування мікроорганізмів до умов навколишнього середовища як біологічної необхідності або пристосування складного багатоклітинного організму до фізіологічних потреб при зміні внутрішніх та зовнішніх умов.

Клітини живих організмів володіють здатністю синтезувати величезну кількість різноманітних білків. Проте вони ніколи не синтезують всі білки. Кількість і різноманітність білків, зокрема ферментів, визначаються ступенем їх участі в метаболізмі. Більше того, інтенсивність обміну регулюється швидкістю синтезу білка і паралельно контролюється алостеричним шляхом.

Таким чином, синтез білка регулюється зовнішніми та внутрішніми чинниками і умовами, які диктують клітині синтез такої кількості білка й такого їх набору, які необхідні для виконання фізіологічних функцій. Все це свідчить про досить складний, тонкий і доцільний механізм регуляції експресії генів у клітині.

Загальну теорію регуляції експресії генів у прокаріот розробили французькі вчені, лауреати Нобелівської премії Ф. Жакоб і Ж. Моно. Суть цієї теорії зводиться до „виключення” або „включення” генів до можливості або неможливості прояву їх здатності передавати закодовану в структурних генах ДНК генетичну інформацію на синтез специфічних білків.

Ця теорія, доведена в дослідах на бактеріях, отримала широке визнання, хоч в клітинах еукаріот механізми регуляції експресії генів, очевидно, є складнішими. У бактерій доведена і н д у к ц і я ф е р м е н т і в (синтез ферментів de novo) при додаванні в поживне середовище субстратів цих ферментів. Додавання кінцевих продуктів реакції, утворення яких каталізується цими ж ферментами, навпаки, викликає зменшення кількості ферментів, що синтезуються. Це останнє явище отримало назву р е п р е с і ї синтезу ферментів. Обидва явища - індукція та репресія – взаємопов’язані.

Згідно теорії Ф. Жакоба і Ж. Моно, в біосинтезі білка у бактерій беруть участь принаймні 3 типи генів: структурні гени, ген-регулятор і ген-оператор. Структурні гени визначають первинну структуру білка, що синтезується. Саме ці гени в ланцюзі ДНК є основою для біосинтезу мРНК, яка потім поступає в рибосому і, як було вказано, служить матрицею для біосинтезу білка. Регуляція синтезу білка шляхом індукції представлена на рис. 8.33.

Синтез мРНК на структурних генах молекули ДНК безпосередньо контролюється певною ділянкою – г е н о м – о п е р а т о р о м. Він служить як би пусковим механізмом для функціонування структурних генів. Ген-оператор локалізований на кінці структурного гена або структурних генів, ним регульованих. „Зчитування” генетичного коду, тобто формування мРНК, починається з п р о м о т о р а – ділянки ДНК, розташованого поряд з геном-оператором і є точкою ініціації для синтезу мРНК, розповсюджується послідовно уздовж оператора та структурних генів. Синтезовану молекулу мРНК, що кодує синтез декількох різних білків, прийнято називати полігенним (поліцистронним) транскриптом. Координований одним оператором окремий ген або група структурних генів утворює о п е р о н.

У свою чергу, діяльність оперону знаходиться під контролюючим впливом іншої ділянки ланцюга ДНК, що отримала назву г е н а – р е г у л я т о р а. Структурні гени і ген-регулятор розташовані в різних ділянках ланцюга ДНК, тому зв’язок між ними, як припускають Ф. Жакоб і Ж. Моно, здійснюється за допомогою речовини - посередника, що виявився білком і названого р е п р е с о р о м. Утворення репресора відбувається в рибосомах ядра на матриці специфічної мРНК, синтезованого на гені-регуляторі.

Репресор має спорідненість до гена – оператора і зворотно зв’язується з ним у комплекс. Утворення такого комплексу призводить до блокування синтезу мРНК і,відповідно, синтезу білка, тобто функція гена – регулятора полягає в тому, щоб через білок - репресор припинити (заборонити) діяльність структурних генів, які синтезують мРНК. Репресор, крім цього, може строго специфічно сполучатися з певними низькомолекулярними речовинами і н д у к то р а м и або ефекторами.

Якщо такий індуктор з’єднується з репресором, то останній втрачає здатність зв’язуватися з геном-оператором, який, таким чином, виходить з-під контролю гена-регулятора, і починається синтез мРНК. Це типовий приклад негативної форми контролю, коли індуктор, з’єднуючись з білком-репресором, викликає зміни його третинної структури настільки, що репресор втрачає здатність зв’язуватися з геном-оператором.

Механізм описаної регуляції синтезу білка і взаємовідношення репресора із структурними генами були доведені в дослідах з Е.coli на прикладі синтезу β-галактозидази (лактази) - ферменту, який розщеплює молочний цукор на глюкозу і галактозу. Дикий штам Е.соli росте на глюкозі. Якщо замість глюкози в поживне середовище додати лактозу (нове джерело енергії і вуглецю), то штам не буде рости, поки не будуть синтезовані відповідні ферменти (адаптивний синтез).

Репресія Lac-оперону має місце в присутності достатньої кількості глюкози. У цьому стані синтез β-галактозидази та інших ферментів метаболізму лактози не відбувається. Оскільки глюкоза є катаболітом лактози, тому стан гальмування синтезу ферментів метаболізму лактози в присутності глюкози отримав назву катаболітної репресії, хоч глюкоза не виступає безпосереднім репресором, а впливає на синтез зазначених ферментів більш складним шляхом.

Індукція Lac-оперону. При поступленні до клітини лактози (індуктор) молекули її зв’язуються з білком-репресором і блокують зв’язок між репресором і геном-оператором. Ген-оператор і структурні гени при цьому починають знову функціонувати і синтезувати необхідну мРНК, яка „дає команду” рибосомам синтезувати β-галактозидазу.

Одночасно ген-регулятор продовжує виробляти репресор, але останній блокується новими молекулами лактози, тому синтез ферменту продовжується. Як тільки молекули лактози будуть повністю розщеплені, репресор звільняється і, поступивши в ДНК, зв’язує ген-оператор і блокує синтез мРНК, а отже, синтез β-галактозидази в рибосомах.

Таким чином, біосинтез мРНК, яка контролює синтез білка в рибосомах, залежить від функціонального стану репресора. Цей репресор є тетрамерний білок із М.м. близько 150000 Да. Якщо він знаходиться в активному стані, тобто не пов’язаний з індуктором, то блокує ген-оператор і синтезу мРНК не проходить. При надходженні метаболіта - індуктора- в клітину його молекули зв’язують репресор, перетворюють його в неактивну форму (або, можливо, знижують його спорідненість до гена-оператора). Структурні гени виходять з-під контролю і починають синтезувати потрібну мРНК.

Як було вказано, концентрація ряду ферментів в клітинах різко знижується при підвищенні вмісту кінцевих продуктів, що утворюються в ланцюзі послідовних ферментативних реакцій. Такий ефект отримав назву р е п р е с і ї ф е р м е н т і в, часто спостерігається при реакціях біосинтезу. У цих випадках молекули репресора, які також утворюються в рибосомах ядра, по „команді” гена-регулятора, є неактивними і не мають здатності пригнічувати діяльність гена-оператора і, отже, всього оперону, але набувають такої здатності після утворення комплексу з кінцевим або одним з кінцевих продуктів біосинтетичного процесу (рис. 8.34).

Рис. 8.34. Регуляція синтезу білка шляхом репресії (схема)

Кінцевий продукт виступає, таким чином, як к о р е п р е с о р. Є дані, що як корепресор в синтезі ферментів обміну амінокислот, мабуть, виступає не тільки вільна амінокислота як кінцевий продукт біосинтетичної реакції, але і комплекс її з тРНК-аміноацил-тРНК.

Синтез ферментів Lac-оперону контролює також особливий білок - активатор катаболітних генів (САР). Цей білок при взаємодії з цАМФ утворює комплекс, який сприяє прикріпленню РНК-полімерази до промоторної ділянки геному. Зв'язування РНК-полімерази з промотором та ініціація транскрипції можливі лише за умов утворення комплексу САР-цАМФ та сполучення цього комплексу з певною ділянкою ДНК промотора.

8.3.2. Особливості молекулярної організації та експресії геному в еукаріотів. Регуляція експресії генів у еукаріот здійснюється значно складнішим шляхом, оскільки процеси транскрипції і трансляції розділені не тільки просторово ядерною біомембраною, але і в часі. Ця регуляція базується на складних біологічних процесах, що визначають швидкість синтезу і розпаду генетичного продукту

Для більшості клітин еукаріот, як і клітин прокаріот, стадія ініціації транскрипції є основною, головною регуляторною точкою експресії активності генів. Проте є істотні відмінності: по-перше, місце процесів транскрипції (у ядрі) і трансляції (у цитоплазмі); по-друге, активування транскрипції в еукаріот пов’язане з безліччю складних змін структури хроматину; по-третє, в клітинах еукаріотів переважають позитивні регуляторні механізми над негативними.

Позитивна або негативна регуляція визначається типом білків, залучених у механізм регуляції. Отримані докази існування білків, що беруть участь у регуляції процесу ініціації транскрипції, опосередкованого через РНК-полімеразу: специфічні чинники, репресори та активатори. Перші викликають зміну специфічності РНК-полімерази до даного промотора або групи промоторів; репресори зв’язуються з промотором, блокуючи тим самим доступ РНК-полімерази до промотора; активатори, навпаки, зв’язуються поблизу промоторної ділянки, підвищують зв’язування промотора і РНК-полімерази.

У еукаріот виділені і охарактеризовані п’ять регуляторних білків, що отримали назву чинників транскрипції (ТF: IIA, IIВ, IID i IIF). Вони необхідні для пізнавання ділянки (сайту) ДНК, названого ТАТА (сопсеnsuns послідовності, ТАТАААА). Детальний молекулярний механізм дії чинників транскрипції поки не розкритий.

Детальніше в структурному і функціональному відношенні в еукаріот вивчена група білків, що отримали назву білків-активаторів транскрипції. Ці білки мають специфічні структурні домени для зв’язування з іншими, але певними регуляторними нуклеотидними послідовностями в молекулі ДНК. Зокрема, вони містять домен, що специфічно зв’язується з ДНК, і один або декілька доменів, необхідних для активування або взаємодії з іншими регуляторними білками. Серед цих бiлков - активаторів транскрипції є білки, що містять багаті глутаміном і проліном домени. Слід зазначити, проте, що деякі з них або майже всі регуляторні білки активують транскрипцію не прямо, а опосередковано - через проміжні білки, названі коактиваторами. Походження і механізм дії останніх також не з’ясовані.

Розглянемо питання про регуляцію процесів диференціювання клітин вищих організмів. ДНК, присутня у всіх соматичних клітинах, найімовірніше, має однакову первинну структуру в даного організму і відповідно містить інформацію про синтез будь-яких або всіх білків організму. Проте клітини печінки, наприклад, синтезують сироваткові білки, а клітини молочної залози - білки молока. Немає сумніву в тому, що в диференційованих клітинах є також тонкий механізм контролю діяльності ДНК у різних тканинах, що забезпечує синтез різноманітних білків.

Крім механімів, подібних у прокаріотів, у контролі генної експресії в еукаріотичних клітинах беруть участь процеси, що здійснюють регуляторну дію на різних рівнях експресії генів:

- на рівні структурної організації геному - регуляція здійснюється за рахунок наявності специфічних послідовностей нуклеотидів, генних перебудов (рекомбінації генів), ампліфікації генів.

- на рівні транскрипції - аналогічно з індукцією ферментів у бактерій і в цьому випадку в клітинах тварин повинні діяти аналогічні репресори. З молекулою ДНК у еукаріот пов’язані гістони, тому вважається, що саме ці білки виконують роль репресорів. На рівні транскрипції регуляторними механізмами є вплив сигналів посилення (енхансерів) та послаблення (атенюаторів) транскрипції.

Висловлено припущення, що в ядрі синтезується високомолекулярна мРНК, що містить інформацію для синтезу широкої різноманітності білків, але в цитоплазму потрапляє тільки невелика частина зрілої мРНК, а основна частина її розпадається.

Регуляція біосинтезу білків на рівні транскрипції має місце в організмі людини. Наприклад, стероїдні гормони і тироксин взаємодіють з хроматином, стимулюють синтез деяких мРНК і відповідно білків.

- на рівні трансляції - за рахунок регуляції зворотного фосфорилювання – дефосфорилюваннябілкових факторів трансляції, а також регулюється шляхом специфічної вибіркової взаємодії рибосом з певними молекулами мРНК.

8.3.2.1. Молекулярна організація ДНК еукаріотів. Гаплоїдний геном кожної клітини організму людини містить 3,5·10⁹ пар азотистих основ і складається з 23 пар хромосом, що є достатнім для утворення близько 1,5 млн пар генів. У еукаріот ДНК знаходиться в хромосомах. Останні мають різну форму і складну структурну організацію. У кожній хромосомі (їх кількість є видовим признаком) міститься одна гігантська молекула ДНК (М.м. приблизно 10¹¹ Да), яка становить основу хроматину.

Хроматин являє собою надмолекулярну структуру, де двохланцюгова ДНК утворює складний комплекс з білками, невеликою кількістю РНК і неорганічними речовинами. Співвідношення компонентів хроматину (%): ДНК – 30 - 45, гістони 30 - 50, негістонові білки 4 - 33 і РНК 1,5 - 10. Структурна організація хроматину така, що дозволяє реалізувати одну і цю ж генетичну інформацію ДНК, властиву даному виду організму, по – різному в спеціалізованих клітинах.

Основна частина хроматину неактивна. Вона містить щільно упаковану ДНК. Активний хроматин становить у різних клітинах від 2 до 11 %. У клітинах головного мозку його найбільше - 10 - 11 %, у клітинах печінки – 3 – 4 % і нирок – 2 – 3 %.

Реально в організмі людини синтезується біля 100 000 різних білків, тобто більша частина ядерної ДНК геному людини не транслюється в амінокислотну послідовність білкових молекул.

Наявність значної кількості ділянок, що не транскрибуються є специфічною особливістю структури геному клітин еукаріотів. Такі ділянки отримали назву і н т р о н і в, на відміну від е к з о н і в – ділянок геному, які транскрибуються з утворенням мРНК, що несуть інформацію про синтез специфічних білків.

Згідно даних літератури (L. Stryer, 1995) тільки 2 % ДНК клітин ссавців містять інформацію для кодування білків організму.

Подвійні, двохспіральні та кільцеві форми ДНК в просторі утворюють спіралізовані і суперспіралізовані форми, тобто утворюють третинні структури. Наприклад, у хромосомі кишечної палички ДНК має довжину більше 1 мм, хоч довжина клітини не перевищує 5 мкм. Суперспіральна (суперскручена) структура забезпечує економну упаковку великої молекули ДНК в хромосомі; замість 8 см довжини, яку вона могла б мати у витягнутій формі, в хромосомі ДНК настільки щільно упакована, що її довжина вкладається в 5 нм. Третинна структура ДНК еукаріот, як і прокаріот, виражена в багаторазовій суперспіралізації, але в еукаріот вона реалізується в формі комплексів ДНК з білками.

ДНК еукаріот майже вся знаходиться в хромосомах ядер, лише незначна її кількість міститься в мітохондріях, а в рослин і в пластидах. Хроматин містить ДНК, гістонові і негістонові білки, невелику кількість РНК та іони металів. До 50 % хроматину припадає на білки гістони, які за вмістом у них залишків амінокислот аргініну і лізину поділяються на п’ять груп: Н₁, Н_2а, Н_2в, Н₃, Н₄. Так, Н₁ багатий лізином, а Н₄ - аргініном. Гістони взаємодіють з ДНК в основному через іонні зв’язки, що утворюються між від’ємно зарядженими фосфатними групами ДНК і позитивно зарядженими лізиновими і аргініновими залишками гістонів. Приблизно 2/3 маси хроматину становлять білки, 1/3 - ДНК. Хроматин містить також РНК (до 10 %). Половина всіх білків хроматину - це гістони (молекулярна маса 11000-22000). Негістонові білки містять велику кількість кислих амінокислот (глутамінової і аспарагінової), тобто є поліаніонами.

На електронно-мікроскопічних фотографіях хроматину видно утворення, що нагадують намисто, нанизане на нитку. Кожна бусина містить 8 молекул гістонів і намотану на них ДНК довжиною біля 150 нуклеотидних пар. Таку структуру називають нуклеосомою (рис.8.35).

При такій упаковці довжина молекули ДНК зменшується в 7 разів. Подвійна спіраль ДНК ззовні огортає білкове ядро нуклеосоми, утворюючи третинну структуру. Приблизно 90 % ДНК входить до складу нуклеосом, решта припадає на перемички. Вважається, що нуклеосоми - це фрагменти “мовчазного” хроматину, а перемички - активного. Однак нуклеосоми можуть розгортатися і переходити в лінійну форму.

Розгорнуті нуклеосоми є активним хроматином. Весь нуклеосомний ланцюг, що містить негістонові білки та РНК, багаторазово спіралізується і укладається в хромосомах у вигляді соленоїда. Останні утворюють петлі, що сприяє укладці хроматину, при цьому лінійні розміри ДНК зменшуються в 10⁴ разів.

8.3.2.2. Послідовності ДНК, що повторюються. Дослідження нуклеотидних послідовностей ДНК вищих організмів виявило наявність багатьох копій – від 2 до 10⁷ повторів на клітину. В геномі людини повтори складають 20 – 30 % від його загальної довжини.

Залежно від кількості нуклеотидів. Та кратності їх повторення послідовності нуклеотидів, що повторюються розділяють на такі класи:

- високоповторні послідовності містять від 5 до 500 пар нуклеотидів, -розташованих один за одним („тандемно”). Такі послідовності транскрипційно неактивні, утворюють кластери, що містять від 1 до 10 млн копій і становлять фракцію „сателітної ДНК”;

- помірноповторні послідовності, які мають не більше, ніж 10⁶ копій і не утворюють тандемних кластерів, а чергуються з певними нуклеотидними послідовностями („дисперговані повтори”), Ці послідовності можуть бути як короткими, так і довгими (5- 7 тисяч пар нуклеотидів).

Короткі дисперговані повтори – це фрагменти ДНК довжиною від одиниць до декількох сотень пар нуклеотидів. Ці повтори можуть транскрибуватися у вигляді компонентів гяРНК та індивідуальних клітинних РНК – 4,5s - i 7s – РНК. Вважають, що ці послідовності є мобільними елементами геному, які здатні до транспозиції, тобто вирізання і вбудовування в різні ділянки геному.

8.3.2.3. Ядерний хроматин та хромосоми еукаріотів. У клітинах тварин і людини реплікація ДНК відбувається у ядрі в певний період клітинного циклу – S - фазу, яка відокремлена від мітозу (М) пресинтетичною (G₁) та постсинтетичною (G₂). Фази S, G₁, G₂ складають „інтерміотичний період”- інтерфазу, G_о – період репродуктивного спокою.

Поділ клітин проходить шляхом мітозу (грец. мітоз - нитка) і амітозу. Комплекс процесів, у результаті яких із однієї клітини утворюється дві нові, прийнято називати мітотичним циклом. Він включає період самого мітозу та інтерфазу – проміжок між діленнями клітини.

Синтез ДНК стимулюють мітогенні сигнали, деякі гормони та ростові фактори. Спочатку клітина із стану спокою Go вступає у G₁-фазу, в процесі якої синтезуються ферменти і білки, необхідні для синтезу ДНК. У S- фазу відбувається синтез ДНК і диплоїдна клітина, що містить дві копії геному, перетворюється в тетраплоїдну (містить чотири копії геному), а в процесі мітозу вона ділиться і утворює дві дочірні диплоїдні клітини (рис. 8.36.).

Під час інтерфази в клітині здійснюються всі основні процеси обміну речовин та енергії. Хромосоми в цей період зберігають свою індивідуальність. Молекули ДНК знаходяться в деспіралізованому стані та спрямовують синтетичні реакції в клітині. Перед поділом здійснюється процес самоподвоєння молекул ДНК у хромосомах ядра (редуплікація).

Вміст ядра називається ядерним соком (каріоплазмою). У ядрі знаходиться хроматин (грец. хромос – фарба). У прокаріот хроматин складається лише із молекул ДНК, а в еукаріот – із ДНК, основних низькомолекулярних білків (гістонів), ферментів реплікації, невеликої кількості кислих білків і РНК. В інтерфазному ядрі, тобто в період між діленнями клітини, хроматин знаходиться у вигляді тонких ниток і щільних зерен різного розміру (гетерохроматин).

У процесі мітозу в результаті конденсації і скорочення тонких ниток та злиття окремих глибок хроматину формуються паличкоподібні хромосоми. В період інтерфази в ядрі клітини здійснюються складні процеси біосинтезу ДНК, яка входить до складу хроматину, а також відбувається синтез іРНК (транскрипція – зчитування інформації про структуру білка).

Каріотип – це специфічний для кожного виду організмів набір хромосом; характеризується кількістю хромосом та особливістю їх будови. Кожен вид організмів має характерний і постійний набір хромосом. У людини нормальний каріотип складається з 46 хромосом тоді, як у шимпанзе, горили – 48. Нормальні каріотипи людини - 46, XX (жіночий) і 46, XY (чоловічий).

Порушення нормального каріотипу в людини виникають на ранніх стадіях розвитку організму. Якщо таке порушення виникає при гаметогенезі, в якому продукуються статеві клітини батьків, то каріотип зиготи, що утворилася при їх злитті, також виявляється порушеним. При подальшому поділі такої зиготи всі клітини ембріону і розвиток з нього організму мають однаковий аномальний каріотип.

Однак порушення каріотипу можуть виникнути і на ранніх стадіях дроблення зиготи. Організм, що розвинувся з такої зиготи, містить кілька ліній клітин (клітинних клонів) з різними каріотипами, така множинність каріотипів всього організму або окремих його органів називається мозаїцизмом.

Як правило, порушення каріотипу у людини супроводжуються множинними вадами розвитку; більшість таких аномалій несумісна з життям і призводить до мимовільних абортів на ранніх стадіях вагітності. Однак досить велика кількість плодів (приблизно 2,5 % з аномальним каріотипом доношується до закінчення вагітності. Деякі хвороби людини, викликані аномаліями каріотипів: синдром Клайнфельтера полісомія по X-хромосомі у чоловіків, синдром Шерешевського - Тернера моносомія по X хромосомі, синдром Дауна Трисомія по 21-й хромосомі.

8.3.2.4. Ковалентна модифікація гістонів та негістонових білків. Гістони та негістонові білки, що входять до складу нуклеосом хроматину, підлягають процесам посттрансляційної ковалентної модифікації, яка змінює їх здатність до взаємодії з певними ділянками ДНК, і може бути одним із біохімічних механізмів контролю ступеня експресії генів.

До ковалентної модифікації білків ядерного хроматину належить їх ацетилювання, фосфорилювання, метилювання, глікозилювання, АДФ-рибозилювання. Відповідні радикали (ацетильні, фосфорильні, метильні, глікозильні, АДФ-рибозильні) сполучаються з бічними ланцюгами амінокислотних залишків у поліпептидних ланцюгах гістонів та негістонових білків.Певні функціональні кореляції з активністю геному виявлені лише при ацетилюванні та фосфорилюванні.

Ацетилювання гістонів починається у цитоплазмі (ацетилювання N-кінцевого серину гістону Н4) і завершується у ядрі. Це призводить до розрихлення комплексу гістон-ДНК у складі нуклеосом.

Фосфорилювання-дефосфорилювання білків хроматину (гідроксильних групзалишків серину та треоніну – реакції відбуваються у цитоплазмі і ядрі. Встановлено, що що протягом різних фаз клітинного циклузворотнофосфорилюються як гістони (Н1, Н3), так і окремі негістонові білки.

8.3.2.5. Генетичні рекомбінації геному прокаріотів. Генетичні рекомбінації – це обмін фрагментами ДНК між різними генами або об’єднанням генів із різних біологічних джерел з утворенням нових хромосомних структур, здатних до реплікації і генетичної експресії.

Генетичні рекомбінації мають місце в біологічних системах різного ступеня складності – від вірусів і бактеріофагів до вищих організмів, що є рушійною силою мінливості, що має важливе значення у формуванні індивідуальності на рівні окремих особин в межах біологічного виду, так і в утворенні видів у процесі еволюції. Г

Генетичні рекомбінації включають ферментативні процеси „розрізання” молекул реципієнтних ДНК за участю специфічних ДНК-аз та включення в молекулу ДНК чужорідних полінуклеотидних фрагментів з іншої хромосоми – транспозонів; зшивання фрагментів ДНК – лігазами завершує процес перенесення гена.

До генетичних рекомбінацій у прокаріотів належать:

- трасформація – процес включення в геном реципієнтного мікроорганізму ДНК з донорської загиблої клітини того ж виду;

- трансдукція - перенесення бактеріофагом фрагмента ДНК інфікованої клітини в склад геному іншого реципієнтного мікроорганізму;

- кон’югація – процес статевого розмноження, що має місце у деяких видів бактерій і полягає у перенесенні фрагмента ДНК з донорської (F⁺) до реципієнтної (F^-)клітини.

8.3.2.6. Процеси рекомбінації в еукаріотів на прикладі утворення Н- та L-ланцюгів імуноглобулінів. У вищих організмів (хребетних, ссавців) рекомбінації генів є важливим елементом статевого розмноження. При утворенні заплідненої зиготи з яйцеклітини та сперматозоїда гаплоїдні батьківські та материнські хромосоми обмінюються відповідними гомологічними ділянками, що дає можливість нащадкам набувати фенотипових властивостей обох батьківських особин.

Процеси переміщення (транслокації, транспозиції) окремих генів або груп генів в інше місце геному мають місце в генах В – лімфоцитів, що кодують утворення імуноглобулінів. Такі генетичні рекомбінації забезпечують синтез мільйонів різних антитіл у відповідь на проникнення в організм чужорідних антигенів.

Антитіла, або імуноглобуліни, – це група білків з характерними особливостями будови, функцій і регуляції біосинтезу. З ними пов’язана несприятливість до інфекційних захворювань (імунітет). Антитіла синтезуються в лімфоцитах В (головним чином у лімфатичних вузлах і селезінці), виділяються у кров, утворюючи фракцію імуноглобулінів плазми. Вони здатні розпізнавати і знищувати чужорідні макромолекули, паразитарні організми і мутантні клітини. Так, в організмі кожної людини утворюється біля 10 млн (10⁷) різних антитіл, кількість яких значно більша, ніж всіх решта існуючих білків.

Структурну основу імуноглобулінів становить чотири поліпептидні ланцюги, з’єднані один з одним дисульфідними зв’язками: два важкі (ланцюги Н) з М.м. 50 000 Да, і два легкі (ланцюги L) з М.м.25 000 Да (рис. 8. 37.).

У пептидних ланцюгах розрізняють варіабельні (V) і постійні, або константні (С) ділянки. За відмінностями первинної структури постійних ділянок легкі ланцюги (L-ланцюги) ділять на два типи (κ і λ), важкі - на п’ять типів. За типом важких ланцюгів (Н-ланцюгів), всі імуноглобуліни ділять на п’ять класів. Кожний клас включає велику кількість індивідуальних імуноглобулінів, які відрізняються первинною структурою варіабельних ділянок; загальна кількість індивідуальних імуноглобулінів всіх класів приблизно 10⁷. Молекули антитіл класів IgG, IgD і IgE мономери; вони мають Y-подібну форму. Антитіла IgА побудовані з 2 – 4 ланцюгових структур, а IgМ - із п’яти.

Синтез L-ланцюгів відбувається за рахунок експресії трьох сімейств генів, що утворюють варіабельний (V_L), з’єднувальний (J_L) та константний (С_L) сегменти. Три сімейства, що кодують синтез легких ланцюгів типу каппа, локалізовані у 2-й хромосомі, ланцюгів типу лямбда – в 22–й хромосомі. У галоїдному хромосомному наборі міститься близько 500 генів сімейства V_L, 5- 6 генів типу J_L та 10 – 20 генів типу C_L.

Синтез Н-ланцюгів імуноглобулінів кодується генами чотирьох сімейств, що утворюють V_н-, D-, J_н-, C_н - сегменти у складі 14- тої хромосоми. Кодування варіабельної ділянки важкого ланцюга відбувається за рахунок зближення генів із сімейств V_н (250 – 300 генів), D (15- 20 генів) та J_н (4 гени).

За рахунок утворення різних сполучень трьох генів сімейства V_L,J_L, С_L за умов синтезу легких ланцюгів та чотирьох генів сімейства V_н-, D-, J_н-, C_н при синтезі важких ланцюгів в імунній системі формуються клони лімфоцитів з різноманітною кількістю генів, які забезпечують експресію великої кількості імуноглобулінів з різною антигенною специфічністю та функціональними властивостями.

8.3.2.7. Ампліфікація генів. Ампліфікація генів – процес збільшення кількості копій відповідних генів, що виникає внаслідок багаторазової („вибухоподібної”) ініціації синтезу ДНК (реплікації) в тому ж самому реплікаційному сайті.

Прикладом ампліфікації генів у еукаріот є:

- ампліфікація генів металотіонеїну – білка, що зв’язує токсичні іони важких металів (ртуті, цинку, кадмію). При попаданні в організм цих металів зростає частота транскрипції металотіонеїнового гена в десятки разів, що є основою детоксикації важких металів.

- ампліфікація гена дигідрофолатредуктази і збільшення рівня синтезу ферменту дигідрофолатредуктази спостерігається в умовах введення в організм онкологічних хворих метотрексату. В основі дії препарату лежить інгібування активності дигідрофолатредуктази, що порушує синтез нуклеїнових кислот у клітинах злоякісних клітин.

8.3.2.8. Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції. До складу системи регуляції транскрипції входять:

- промотори, специфічні для різних РНК – полімераз, але мають спільну нуклеотидну послідовність (ТАТА...), з цим нуклеотидним блоком взаємодіє РНК – полімераза ІІ;

- специфічні послідовності матричної ДНК, які посилюють або послаблюють рівень експресії структурних генів, впливають на активність транскрипції (кількість мРНК, що синтезується), швидкість їх утворення – енхансерні (підсилювальні), атенюаторні (послаблювальні), сайленсерні (заглушувальні), адапторні елементи геному.

Енхансери – позитивні регулятори – це ділянки ДНК, які містять декілька десятків пар азотистих основ –„ модулей”, що тандемно повторюються. Енхансери збільшують активність відповідних генів, на які вони впливають, в десятки і сотні разів. Відомо нуклеотидні послідовності енхансерів для багатьох ферментних білків (хімотрипсину, алкогольдегідрогенази), гормонів (інсуліну, плацентарного лактогену). імуноглобулінів.

Крім цього, при взаємодії з певними білковими факторами деякі енхансери можуть виступати як негативні регулятори – сайленсери, що гальмують експресію відповідних генів.

На даний час виділено білки, що здатні до взаємодії з певними енхансерами. Ці білки можуть взаємодіяти з регуляторними послідовностями ДНК, які розташовані на значній відстані від сайтів взаємодії з РНК –полімеразою та ініціації транскрипції. Такий дистантний вплив регуляторних білків реалізується за рахунок змін у просторовій конформації ланцюгів ДНК і утворенні внутрішніх петель, що зближує регуляторні ділянки геному з ділянками, які транскрибуються.

В адаптації організму вищих тварин до умов середовища, важлива роль належить стероїдним гормонам кори наднирників, дія яких пов’язана зі специфічними рецепторами, що взаємодіють з певними енхансерами ділянки геному, активуючи транскрипцію ДНК з певних генів.

8.3.2.9. Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні трансляції. Регуляція біосинтезу білка на рівні трансляції здійснюється за механізмом ковалентної модифікації білкових факторів трансляції шляхом зворотного фосфорилювання – дефосфорилювання за участю цАМФ – залежного регуляторного каскаду клітин.

Контроль вступу клітин до мітозу

Реплікація ДНК відбувається протягом S-фази клітинного циклу, а мітоз (розподіл хромосомного матеріалу) починається після підготовчої G₂- фази. Перед вступом в М-фазу відбувається конденсація хроматину, розщеплення ядерної мембрани, реорганізація цитоскелету з формуванням мітотичного веретена.

Основним моментом у переході клітини до М – фази є активація специфічної протеїнкінази (сdc2- білка), яка внаслідок взаємодії з білком цикліном утворює активний комплекс, який фосфорилює численні клітинні білки, необхідні для мітотичного процесу.

Процес мітозу включає послідовність таких біохімічних реакцій:

1. Утворення комплексу кінази сdc2 з цикліном. Білок циклін з молекулярною масою 45 000 Да, концентрація якого збільшується в інтерфазу і падає в кінці мітозу.

2. Фосфорилювання сdc2 – кінази, що знаходиться в комплексі з цикліном, за залишками тирозину -15 і треоніну – 161. Двічі фосфорильована кіназа є неактивною.

3. Дефосфорилювання в молекулі сdc2 – кінази залишку тирозину -15, з утворенням молекулярної форми ферменту, залишається фосфорильованою за треоніном -161 і є каталітично активною.

4. Каталітично активна сdc2 – кіназа спричинює фосфорилювання клітинних білків - ламінінів ядерної мембрани, що призводить до її розщеплення; білків мікротрубочок, що формують мітотичне вереттено; н1 – пістонів, фосфорилюванння яких веде до конденсації ядерного хроматину.

Розщеплення комплексу сdc2 – кіназа – циклін обмежує активність сdc2 – кінази. Взаємодія комплексу сdc2 – кіназа – циклін з низькомолекулярним білком убіквітином (М.м 8500 Да) призводить до обмеженого протеолізу цикліну і припинення клітинних реакцій, що реалізують процес мітозу.

8.3.3. Генні (точкові мутації). Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів. Мутації – зміни генетичної програми ДНК клітин, що призводять до зміни спадкових властивостей внаслідок кількісних та якісних змін у генотипі організму.

Мутації можуть бути спонтанними, викликаними різними природними факторами та індукованими, спричиненими штучними факторами. Спонтанні мутації досить рідкісні. При реплікації становлять один помилковий нуклеотид на 10^-6 - 10^-9 нуклеотидів, при транскрипції – на 10^-5 - 10^-6 і при трансляції - на 10^-4. Фактори, що викликають мутації, називають мутагенами.

Залежно від змін у структурі генетичного апарату організму мутації поділяють на:

- геномні – зміна кількості повного набору хромосом або окремих хромосом у диплоїдному наборі, що призводить до важких хромосомних хвороб людини;

- хромосомні – пов’язані з структурними змінами певних хромосом (хромосомні аберації) внаслідок переміщення, втрати, або дуплікації окремих фрагментів хромосомної ДНК.

Хромосомні мутації поділяють на:

- транспозиції – перенесення фрагмента ДНК в іншу ділянку хромосоми;

- транслокації – перенесення ділянки однієї хромосоми на іншу хромосому;

- інверсії – зміна в певній ділянці хромосоми послідовності генів (азотистих основ) на іншу, зворотну послідовність;

- делеції – випадіння певних ділянок хромосоми (фрагментів ДНК);

- дуплікації – подвоєння певних ділянок хромосом;

генні (точкові) – зміни в структурі геному, що полягають в порушенні послідовності азотистих основ (нуклеотидів), які складають первинну структуру ДНК. Генні мутації поділяють на такі типи:

- заміни нуклеотидів – найбільш поширені генні мутації, до яких належать:

а) транзиції – заміна пар основ;

б) трансверзії – заміна одного типу азотистих основ на інший, тобто пурину на піримідин або навпаки;

- делеції або випадіння однієї пари або групи пар основ у ланцюгу ДНК (відповідних нуклеотидів);

- вставки (вбудування) в ланцюг ДНК пари або групи пар основ (нуклеотидів). Кожен вид мутацій викликає різні фенотипічні наслідки (табл.8.3.).

Мутація може бути мовчазною, якщо триплет, в якому знаходиться змінений нуклеотид, із - за виродженності коду шифрує включення у білок цієї ж амінокислоти, що і вихідний кодон. Білок у цьому випадку ідентичний вихідному. Може відбутися заміна однієї амінокислоти на іншу місенс – мутація, яка робить білок менш ефективним.

Може виникати один із термінуючих кодонів: УАА, УАГ, УГА – нонсенс мутація, біосинтез білка припиняється на цьому кодоні і утворюється укорочений білок.

Мутації можуть бути пов’язані з втратою мономерів (делеція) або, навпаки, зі вставкою додаткових мономерів. У випадку делеції одного мономера змінюється зчитування всіх наступних кодонів – це мутація з „зсувом рамки”, в результаті чого утворюється білок з „безсмисловою” послідовністю амінокислот, не придатний для виконання функцій. При делеції двох мономерів також проходить зсув рамки, якщо втрачено три мономери (або число, кратне трьом), то зсуву рамки не буде, але синтезується білок, укорочений на одну (або декілька амінокислот). Вставки додаткових нуклеотидів (в кількості, не кратній трьом) також призводять до зсуву рамки.

Суть генних мутацій становлять спадкові зміни первинної структури ДНК, які призводять до припинення синтезу білка, кодованого пошкодженим геном, або до синтезу зміненого „ неправильного” білка. Генні мутації викликають зміни генетичного коду, порушують порядок чергування нуклеотидів у ДНК та функцію траскриптонів.

Якщо зміни проходять у структурних генах, то може утворитися дефектний білок, не здатний виконувати свою функцію. Мутації в структурних генах РНК можуть призвести до утворення дефектних тРНК і рРНК, що вплине на виконання їх функцій (розпізнавання й транспорт відповідних амінокислот та утворення рибосом).

Мутації в промоторі порушують зв’язування РНК – полімерази, що в кінцевому результаті призводить до недостатнього утворення білка або повного припинення його синтезу. Мутації в акцепторній зоні (операторі у прокаріот) призводять до переходу від регульованого синтезу білка до нерегульованого.

Більшість клітин людини диплоїдні, тобто містять дві копії кожної хромосоми (гомологічні хромосоми). У ДНК кожної хромосоми міститься більше тисячі генів. Відповідні один одному гени у гомологічних хромосомах називають алелями: якщо структури алелей ідентичні, то їх білкові продукти будуть також ідентичні, а індивідуум, який має такі алелі, буде гомозиготним за даною ознакою.

Таблиця 8. 3. Основні види генних мутацій

Вид мутації	Зміни в структурі ДНК	Зміни в структурі білка
Заміна
"Мовчазна" - без зміни смислу кодону	Заміна одного нуклеотиду в кодоні на інший	Білок не змінений
"Місенс – мутація" – із зміною смислу кодону	Заміна одного нуклеотиду в кодоні на інший	Проходить заміна однієї амінокислоти на іншу
"Нонсенс – мутація- з утворенням термінуючого кодону	Заміна одного нуклеотиду в кодоні на інший	Синтез пептидного ланцюга переривається, білок укорочується на одну або декілька амінокислот
Вставка	Включення нуклеотидів у структуру ДНК	Подовження поліпептидного ланцюга ДНК
Без зсуву рамки зчитування інформації	Вставка фрагменту ДНК, із трьох нуклеотидів, або з числа нуклеотидів, кратних трьом	Відбувається подовження поліпептидного ланцюга білка на одну або декілька амінокислот
Із зсувом рамки зчитування інформації	Вставка одного або декількох нуклеотидів у кількість не кратну трьом	Білок за місцем мутації має "випадкову" послідовність амінокислот
Делеція	Випадання нуклеотидів і укорочення молекули ДНК	Укорочення білка
Без зсуву рамки зчитування інформації	Випадання фрагментів ДНК, що складається із трьох нуклеотидів або числа нуклеотидів, кратних трьом	Відбувається укорочення поліпептидного ланцюга білка на одну або декілька амінокислот
Зі зсувом рамки зчитування інформації	Випадання одного або декількох нуклеотидів у кількості не кратній трьом	Білок укорочується, але за місцем мутації має "випадкову" послідовність амінокислот

Якщо у людини є два різні алелі, то має місце гетерозиготне успадкування цього гену. В популяції людей може існувати велика кількість варіантів одного алеля, але кожна людина успадковує тільки два. Білкові продукти, утворені при експресії варіантів одного і того ж гена, називають поліморфами. Поява білків із зниженою функціональною активністю або повністю неактивних призводить до розвитку спадкових захворювань.Так, дефект у структурі гена гістидази, що каталізує дезамінування гістидину, викликає нагромадження цієї амінокислоти в крові і розвиток спадкової патології – гістидинемії, яка проявляється порушенням у розумовому та фізичному розвитку дітей.

Чинники, що спричинюють мутації (мутагени ). Мутагени навколишнього середовища досить чисельні, що призводять до накопичення у наступних поколіннях спадкових захворювань. До мутагенів належать хімічні, фізичні та біологічні фактори навколишнього середовища.

Найбільш поширеними мутагенами є:

- аналоги азотистих основ – сполуки, що заміщують нормальні азотисті основи в ланцюгу ДНК (наприклад, 5 – бромурацил, 2 - амінопурин);

- хімічні мутагени – сполуки, що змінюють структуру азотистих основ нуклеїнових кислот:

а) дезамінуючі агенти – азотиста кислота, нітрити, нітрозаміни. Так, нітрити, нітрати й органічні нітрозаміни утворюють в організмі азотисту кислоту (НNО₂), яка інтенсивно окиснює аміногрупи в гідроксильні.

Азотисті основи в складі ДНК можуть перетворюватися в інші, що зумовлює зміни характеру спарювання основ. Так, цитозин при дезамінуванні переходить в урацил, який під час реплікації утворює комплементарну основу з аденіном. Дезамінування аденіну і гуаніну під дією азотистої кислоти призводить до утворення відповідно гіпоксантину та ксантину.

Заміна одного нуклеотиду в ДНК може призвести до зміни смислу кодону (місенс -мутація) і, відповідно, до синтезу зміненого білка. За рахунок таких мутацій виникли аномальні форми гемоглобінів зі зміненою первинною структурою в β – ланцюгах.

Якщо в результаті заміни утворюється один із термінуючих кодонів – UAA, UAG або UGA (нонсенс - мутація), то синтез поліпептидного ланцюга обривається на цьому кодоні, утворюється незавершений білок.

б) алкілюючі агенти – сполуки, що призводять до метилування (або алкілювання) азотистих основ. Ряд хімічних речовин (похідні іприту, диметилсульфат, епоксиди, алкілнітрозаміни тощо) зумовлюють приєднання до азотистих основ нуклеотидів алкільних груп (метилу, етилу та інших). Наприклад, при метилюванні гуаніну утворюється 6 – О – метилгуанін.

Крім азотистої кислоти і алкілюючих агентів, відомі інші хімічні мутагени – інгібітори синтезу ДНК, вільні радикали, радіотоксини, аналоги пуринових і піримідинових основ, деякі антибіотики. Багато з цих сполук мають протипухлинну (антибластомну) активність і застосовуються у клінічній онкології.

ультрафіолетове (УФ-) та іонізуюче випромінювання – фізичні фактори, мутагенна активність яких пояснюється вільно- радикальними змінами азотистих основ ДНК з утворенням їх аналогів із зміненою будовою. При дії УФ - випромінювання спостерігається утворення димерів із двох сусідніх піримідинових основ, які стоять в одному полінуклеотидному ланцюгу. Частіше утворюються димери тиміну, відбувається їх зшивання ковалентно за місцем подвійного зв’язку. Утворений димер перешкоджає реплікації (протидіє просуванню ДНК – полімераз) і тому повинен бути видалений із ДНК.

8.3.4. Генна інженерія або технологія рекомбінантних ДНК. Генна інженерія, за визначенням О. Баєва, є системою експериментальних методів, що дозволяють створювати в лабораторії (у пробірці) штучні біологічні структури. Як інструменти для генно-інженерних операцій застосовуються створені самою природою ферменти: одні з них розтинають молекулу ДНК в строго певних ділянках (рестриктази), інші, навпаки, зшивають різні ділянки в єдине ціле (лігази). Кінцевою метою генної інженерії є отримання організмів (тварин і рослин) із новими спадковими властивостями за допомогою лабораторних методів.

Для досягнення цієї мети необхідно проведення величезної роботи на рівні окремого гена або генів. Ген, представлений певною ділянкою ДНК і відповідний певному білку, можна виділити з іншого організму або синтезувати хімічним, або біологічним шляхом.

Уперше в 1969 р. з Е. соli була виділена ділянка ДНК з геном, відповідальним за синтез ферменту, що каталізує засвоєння молочного цукру (лактози), - так званий лактозний оперон. Вперше здійснив Хар Гобінд Корану в 1970 р. хімічний синтез гену аланінової тРНК, що складається з 72 нуклеотидів, проте, позбавлений функціональної активності, оскільки в клітинах тРНК синтезується не в готовому вигляді, а у формі попередника. Ці дані послужили основою для синтезу гена-попередника тирозинової тРНК (з 126 нуклеотидів), хоч сама тирозинова тРНК складається з 85 нуклеотидів.

Останніми роками все більше місце займають біологічні методи синтезу генів за допомогою зворотної транскриптази (ревертази). Для цього необхідна мРНК, за допомогою якої можна відтворити відповідний ген. Цим способом синтезовані ДНК-копії на мРНК, що кодує синтез білка глобіну (людини, кролика, миші, голуба, качки), імуноглобуліну, білка кришталика ока тощо.

Наступний етап генної інженерії - перенесення генів у клітину-здійснюється трьома способами: трансформацією (перенесення генів за допомогою виділеної з клітин і звільненої від домішок ДНК), трансдукцією (перенесення генів за допомогою вірусів) і гібридизацією клітин, одержаних з різних організмів (вищих тварин, мікроорганізмів тощо) (рис. 8.38, 8.39.).

Під дією ендонуклеази R₁ Е. соlі кільцеві ДНК розриваються в одній точці і утворюються лінійні нитки. Під впливом іншого ферменту - ендонуклеази (із фага) укорочуються нитки ДНК з протилежних кінців. Далі за участі ферменту кінцевої трансферази нарощуються нитки ДНК, причому в одної ДНК нові кінці містять аденілові (А), у другої - тимідилові (Т) залишки. При змішуванні молекул кінцеві залишки А і Т утворюють комплементарні пари, замикаючи лінійні молекули в кільце. Спочатку ці кільця містять чотири розриви, які потім закриваються з участю ферменту - ДНК лігази.

Дослідження у галузі генної інженерії можуть служити основою для вирішення практичних завдань охорони здоров’я та сільського господарства. Одержані в лабораторії штучні гени, крім широкого використання в мікробіології та фармацевтичній промисловості для приготування кормового білка і лікарських препаратів (інсулін, інтерферон, гормон росту, гормони щитоподібної залози, інтерферони тощо), можливо, зможуть застосовуватися при лікуванні багатьох спадкових захворювань.

Перші спроби застосування лактозного гена при галактоземії (спадкове захворювання, пов’язане з непереносністю галактози внаслідок відсутності ферменту гексозо-1-фосфат-уридилилтрансферази) вселяють надію на реальні практичні можливості генної інженерії.

Відкриття екзонів та інтронів у геномі ДНК, явища сплайсингу (формування зрілої мРНК) вказує на необхідність дотримання високої точності процедури вирізування необхідного гена з ДНК геному відповідними рестриктазами. Інакше можуть бути отримані не структурні трансльовані гени, а інтрони або ділянки екзонів, що не кодують білок.

Після цього, як були розроблені методи штучного синтезу і зшивання окремих ділянок молекули ДНК, появилася можливість конструювання і створення нових, невідомих раніше в природі організмів із наперед заданими властивостями.

Сучасна біотехнологія виявилася логічним розвитком цього напряму науки. Вона склалася на основі фундаментальних досягнень біохімії, генетики і мікробіології, відкрила широкі можливості для створення нових сортів рослин, нових порід тварин тощо.

8.3.3.1. Технологія трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК. На теперішній час інтенсивно розвиваються методи, що дозволяють виділяти гени або їх фрагменти з величезних молекул ДНК, отримувати велику кількість копій цього матеріалу і використовувати його для виявлення:

- мутації в генах;

- інфікування людини бактеріальними або вірусними захворюваннями;

- носіїв патологічних генів, що являються причиною спадкових хвороб, і для ідентифікацій особистості та встановлення родоводу.

З цією метою із тканин і клітин лейкоцитів, слини, сечі, біоптатів, гістологічних зрізів, виділяють ДНК і фрагментують за допомогою гідролітичних ферментів – рестриктаз. Рестриктази впізнають відповідні короткі послідовності нуклеотидів (4-6 нуклеотидних пар) і розщеплюють дві нитки ДНК з утворенням дволанцюгових ("сліпих") або одноланцюгових ("липких") кінців. Кількість кожного ферменту дуже мала, тому потрібний для досліду фермент багаторазово подвоюють (ампліфікують) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або в складі рекомбінатної ДНК.

Рекомбінатні ДНК - ДНК, побудовані з частин різного походження. Їх отримують наступним чином: ДНК з двох різних джерел, найчастіше ДНК людини і ДНК плазміди (невеликих кільцевих молекул ДНК, здатних автономно реплікуватися в бактеріальних клітинах), або вірусу, фрагментують однією і тією ж рестриктазою з утворенням "липких" кінців. Після денатурації молекул нагріванням і наступного повільного охолодження ДНК ренатурує, і поряд з вихідними молекулами за рахунок "липких" кінців утворюється рекомбінатні молекули, що складаються з ділянок ДНК людини і плазміди (вірусу). Ці ділянки зшивають ДНК - лігазою, і гібридну плазміду (вірус) вводять в бактеріальні клітини. При вирощуванні трансформованих бактерій в культурі експресуються "чужі" гени, а з бактеріальної маси можна отримати значну кількість ДНК, мРНК і білка.

Для отримання рекомбінативних ДНК, крім фрагментів ДНК, видалених із клітин тканин, використовують ДНК, синтезовані за допомогою зворотної транскриптази або РНК - залежної ДНК - полімерази. Фермент за принципом комплементарності каталізує синтез ДНК з чотирьох дНТФ на матриці мРНК. Продукт реакції – ДНК, без інтронів, в залежності від ДНК з ядерного матеріалу клітин еукаріотів.

8.3.3.2. Клонування генів з метою одержання біотехнологічних лікарських засобів. Термін “клон” з грецької означає пагін. У сучасному розумінні процес клонування розділяють на два види: 1) клонування клітин; 2) молекулярне клонування.

Коли ми говоримо про клонування клітин, потрібно чітко розрізняти два принципово відмінні напрямки в цьому процесі. Клонування нижчих, здебільшого прокаріотичних, організмів (вірусів, бактерій, грибів або, навіть, популяцій соматичних клітин вищих організмів). В основі цього виду клонування лежить таке явище як трансдукція, а основним методом, що застосовується є технологія рекомбінантної ДНК. Зовсім іншим є клонування високоорганізованих організмів, зокрема, так популярне сьогодні клонування амфібій, ссавців, навіть людини.

Якщо говорити про одержання клонів вищих організмів, то воно значно молодше. Шістдесят років тому німецький ембріолог Ганс Шпеман, який згодом став лауреатом Нобелівської премії, вперше поставив питання про цілісність та ідентичність геному на протязі всього життя організму і запропонував метод перенесення ядра будь-якої спеціалізованої клітини в яйцеклітину, з попередньо знищеним власним ядром. Цим самим вчений відкрив нову еру в розвитку сучасної генетики, біохімії та ембріології.

Показавши тотипотентність клітин ранніх ембріонів морських їжаків та тритонів, доктор Шпеман та його колега доктор Дріш підняли питання про те, на скільки ріст ембріона впливає на модифікацію геному та на скільки диференціація геному соматичних клітин є незворотньою.

У 1952 році з яйцеклітин амфібій вченим вдалося клонувати дорослий організм, а в 1983 році вперше здійснили пересадження ядер споріднених родів мишей. У результаті приблизно 90 % дослідних зразків досягали стадії бластоцисти. Найбільший резонанс отримали результати дослідів, проведених британськими вченими під керівництвом доктора Уілмута (Wilmut), які були присвячені отриманню живого потомства після перенесення ядра, взятого з соматичної клітини дорослої тварини. Легендарна Доллі залишилась однією з восьми живих овець, отриманих з 834 успішно реконструйованих овоцитів.

Широке застосування знайшло клонування і в біотехнології. Найбільше прикладне значення сьогодні має те, яке здійснюють за допомогою вірусів, мікроорганізмів або окремо отриманих культур тканин. Клон вірусу або клітини – це така популяція, кожний організм якої походить від одного репродуктивного віріону або, відповідно, репродуктивної клітини. Всі члени такого штаму-клону генетично ідентичні один одному та материнському організму.

Вірусний клон – це популяція вірусних частинок, які утворилися в результаті реплікації однієї частинки ДНК (у випадку ретровірусів реплікує РНК). За допомогою клонування можна отримати чистий препарат одного геному, оскільки всі члени клону містять ідентичну ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується при отриманні чистих препаратів конкретних молекул рекомбінантної ДНК. Щоб отримати потрібний організм з відповідним геномом, спочатку потрібно трансплантувати необхідний ген в цю клітину, з якої буде розвиватися новий штам мікроорганізмів.

Ген, необхідно ввести в клітину-реципієнт таким чином, щоб він інтегрувався з її геномом. Це дозволяє здійснити технологія рекомбінантної ДНК – набір різноманітних методів, які дозволяють встановити невідому послідовність певної ділянки ДНК або отримати задану.

Важлива роль у вирішенні проблеми штучної рекомбінації генів належить відкриттю рестрикційних ендонуклеаз. Рестриктази синтезуються деякими видами бактерій. Вони здатні впізнавати специфічні послідовності ДНК та розрізають подвійний ланцюг, де трапляються відповідні послідовності (в цьому випадку розріз зроблений між тиміном (Т) та гуаніном (G) у послідовності ТGАТСА). (рис.8.40.).

Так, якщо необхідно з'єднати дві дволанцюгові ДНК, які виділені із різних організмів, то кожну з них обробляють рестрикційною ендонуклеазою. Внаслідок цього настає розрив обох ланцюгів ДНК з утворенням у місці розрізу відкритих кінців, які будуть комплементарні між собою в обох розщеплених ДНК.

Якщо тепер змішати ці ДНК, нагріти і повільно охолодити, то їх "липкі" кінці утворять комплементарні пари основ, у результаті чого виникає нова рекомбінантна ДНК, ланцюги якої мають поодинокі розриви (рис.8.41.).

Піддаючи такі ДНК впливові ДНК-лігаз при наявності джерел енергії, одержують нову ковалентно зшиту рекомбінантну ДНК. Для з'єднання фрагментів ДНК широко застосовується ще один фермент - термінальну трансферазу. Вона здатна приєднувати до З'-кінця ланцюгів ДНК значну кількість дезоксирибонуклеотидних залишків. Термінальна трансфераза проявляє свою дію без матриці і здатна нарощувати З'-кінцеві послідовності із нуклеотидів одного типу. Отже, до 3'-кінців однієї із дволанцюгової ДНК можна додавати полі (Г)-хвости, а до З'-кінців другої — полі (Ц)-хвости. Такі хвости комплементарні між собою і за їх допомогою можна з'єднати дві ДНК за рахунок утворення комплементарних пар між основами їх липких кінців (рис.8.42.). Зшивання, з'єднаних таким способом ДНК, здійснюється ДНК-лігазою.

За допомогою цих та інших ферментів уже з'єднано багато ДНК, одержаних від різних організмів. Наприклад, ДНК мавп'ячого вірусу SV40 була вбудована в ДНК фага λ, тобто були об'єднані хромосоми тваринних і бактеріальних вірусів. Важлива роль у справі розвитку техніки одержання рекомбінантних ДНК належить опрацюванню способів введення чужих генів у клітину-господаря, де вони повинні інтегруватися у геном клітини. Для цього in vitro ген з’єднується з певною ДНК, що виконує роль провідника (вектора).

Найпоширенішими переносниками, які використовуються для внесеннячужих генів у геном кишкової палички, тобто векторами (ДНК, що проникає та реплікує всередині клітини), є плазміди і ДНК фага λ. Плазміда – додаткова кільцева молекула ДНК, яку можна знайти практично в кожного виду бактерій. У кожній плазміді знаходиться від 2000 до 100000 основ. Маленькі плазміди можуть бути наявні у клітині в кількості 20 і більше копій. Плазміди на декілька порядків менші від основної молекули ДНК. Вони мають здатність переноситися від однієї клітини до іншої і навіть від бактерій одного виду до бактерій іншого. У плазміди можна дуже легко вносити чужі гени, які потім можуть переноситися у кишкову паличку і ставати там частиною геному клітини-господаря.

Сьогодні широко застосовують клонування у тваринництві та рослинництві - створення більш продуктивних та менш вимогливих до умов існування трансгенних видів тварин та рослин. Ще одна можливість – клонування рідкісних та практично вимерлих представників флори та фауни. Проте найбільшу увагу, напевно, заслуговують трансгенні тварини-донори органів та окреме клонування органів людини.

Переваги застосування таких органів у клінічній практиці очевидні, адже при пересадці клонованого органу не потрібно думати про гальмування реакції відторгнення та можливих наслідках таких як, наприклад, рак, що часто розвивається на фоні імунодефіциту, або ниркова недостатність, яка виникає при пересадках серця, та багато інших. Клоновані органи стануть рятівними для людей, що потрапили в автокатастрофи, або для тих, кому потрібна радикальна допомога через захворювання старшого віку (“зношене” серце, хвора печінка тощо). Вже сьогодні клонування - центральний метод генної терапії.

8.3.3.3. Ланцюгова полімеразна реакція. У методі ланцюгової полімеразної реакції ( ЛПР), запропонованої американським вченим К. Мюллісом (1983 р), лежить явище ампліфікації генів. Цей метод дозволяє отримати певні фрагменти (послідовності) ДНК геному людини та індентифікувати їх за нуклеотидним складом.

Для проведення ЛПР необхідні РНК – праймери, специфічні до певних ділянок ДНК, яка аналізується та ДНК –полімерази, які здатні реплікувати нуклеотидні послідовності в обох комплементарних ланцюгах, утворюючи значну кількість копій досліджуваного поліунклеотидного фрагмента. Ампліфіковані фрагменти ДНК досліджують за допомогою біохімічних методів.

Фрагменти ДНК довжиною в декілька сотень нуклеотидних пар можна ампліфікувати за допомогою ПЛР в умовах in vitro (в пробірці). Для проведення ПЛР потрібно знати нуклеотидну послідовність кінцевих ділянок фрагменту. У зв’язку з цим хімічним шляхом синтезують два праймери – одноланцюгові олігодезоксинуклеотиди, що складаються з 15 - 30 нуклеотидів, і комплементарних 3 – кінцям двох ниток копіюючої ДНК – матриці.

Реакційна суміш для отримання копій вміщує:

- матрицю – ДНК, виділену із дослідного екземпляру;

- субстрати 4-и дНТФ;

- фермент – термостабільну ДНК – полімеразу (Taq- полімеразу);

- два праймери;

- буфер для створення оптимального рН та іони Mg²⁺, що являються кофактором Taq- полімерази.

Праймери обмежують ділянку ДНК, яка повинна бути ампліфікована.

Кожен цикл отримання копій ДНК включає три стадії: плавлення: реакційну суміж нагрівають до 90 - 95^оС, ДНК денатурує, утворюючи одноланцюгові нитки; гібридизація ДНК з праймерами: температуру знижують до 50 - 60^оС і праймери комплементарно зв’язуються з нитками ДНК; елонгація: приєднання Taq- полімерази до 3' - кінців праймерів і синтез ДНК в напрямку від 5'- до 3'- кінця комплементарно ДНК - матриці.

Процес автоматизований проводиться в приладі – циклізаторі або ампліфікаторі ДНК, який дозволяє задавати потрібну кількість циклів і оптимальні часові та температурні параметри. За 25 - 30 циклів синтезується декілька мільйонів копій (рис. 8.43).

Використовуючи вказані технології і ДНК – конструкції, можна вирішувати наступні завдання:

- вирощувати модифіковані мікроорганізми як продуценти гормонів (інсуліну, гормону росту, соматостатину тощо), біологічно активні пептиди, фактори згортання крові;

- створювати нові види рослин і тварин;

- лікувати спадкові захворювння шляхом введення у клітини генів, які у пацієнтів втрачені або дефектні. Для цих цілей часто використовують полімерні носії – наночастинки, що здійснюють постачання необхідних компонентів у пошкоджені органи і тканини.

За допомогою ЛПР здійснюється так звана "ДНК-діагностика", тобто аналіз певних послідовностей ДНК у клітинах людини, що має першочергове значення в діагностиці спадкових хвороб, виявлення присутності в організмі певних вірусів (у тому числі ВІЛ) ідентифікації особистості.

8.3.4. Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Високу мутагенну активність проявляє радіоактивне випромінювання. Фонова радіація середовища постійно зростає, що збільшує частоту мутацій у людей. За оцінками фахівців, вплив УФ – та іонізуючого випромінювання є причиною більше 10 % усіх пошкоджень ДНК. Іонізуюче випромінювання викликає розриви нуклеотидних ланцюгів і різноманітні зміни азотистих основ. Цим пояснюється летальна дія іонізуючої радіації

Забруднення навколишнього середовища різними хімічними речовинами, чужорідного походження (ксенобіотиками), які постійно впливають на ядерну генетичну ДНК. При дії хімічних речовин відбувається утворення ковалентних зв’язків між ланцюгами ДНК, дезамінування основ, відщеплення основ тощо.

Такі зміни можуть проходити в живій клітині спонтанно, тобто в результаті локальних флуктуацій теплової енергії, а також під дією фонового випромінювання (в тому числі космічного) і деяких речовин, що попадають в організм. Найчастіше проходить гідролітичне відщеплення пуринових основ (депуринізація ДНК), в результаті чого із ДНК диплоїдних клітин людини за добу втрачається біля 5·10⁴ нуклеотидів. З меншою швидкістю (на 2 – 3 порядки) проходить дезамінування цитозину і депіримідинізація.

Вплив на геном живих організмів фізичних та хімічних чинників супроводжується нестабільністю ДНК, що зазнає постійних точкових мутацій. У зв’язку з цим в еволюції живих організмів виникли спеціальні молекулярні механізми, що протидіють постійним ушкодженням ДНК та репарують зміни в молекулярній будові ДНК.\

1. Репарація УФ-індукованих генних мутацій: пігментна ксеродерма. Відновлення нормальної структури ДНК, порушеної утворенням димерів тиміну, реалізується послідовною дією декількох ферментів.

І. Специфічна УФ - ендонуклеаза зв’язується з місцем порушення правильної двохспіральної структури ДНК і розрізає пошкоджений ланцюг біля тимінового димеру.

ІІ. Формування полідезоксирибонуклеотидної ділянки на фрагмент ДНК, що містить димер; реакція каталізується ДНК – полімеразою (у прокаріотів - ДНК –полімераза І) і полягає в приєднанні мононуклеотидів до вільного 3’ – кінця „ розрізаного” ланцюга ДНК в напрямку 5’ – 3’.