Теоретическая справка. Техника приготовления препаратов. Техника приготовления препаратов

к Работе№3

Техника приготовления препаратов

1. Приготовление мазка

1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды

культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят

непосредственно на стекло (без воды) небольшую каплю воды, в ко-

торой эмульгируют исследуемый

материал и распределяют по

площади около 2 см².

№ препарата пишут на лицевой стороне, а с обратной стороны местонахождения мазка обводят восковым карандашом.

2. Высушивание

на воздухе высоко над пламенем спиртовки

мазком вверх

3. Фиксация

Цель: - прикрепить микробов к стеклу

- обеззаразить патогенные микробы

- убитые микробы лучше окрашиваются

Методы

физическийхимический

- над пламенем спиртовки мазком - более щадящий по сравнению

вверх (3 раза круговыми движениями) с физическим: мазок погружа-

ют в фиксатор (этанол, ацетон, формалин и др.) на определенное время

4. Окраска

Методы

простыесложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько краси-

анилинового ряда - основным или телей (основная и вспомога-

кислым: - кислый фуксин тельные краски, обесцвечи-

-эозин вающие жидкости (этанол)

- метиленовый синий - метод Грама

- окраска по Нейссеру

- генциановый фиолетовый - Гинса-Бурри (выявление капсул)

- Циля-Нильсена (выявление

спор)

2) используются для изучения 2) используются для определе-

морфологии микроорганизмов ния не только морфологии, но

и химического состава и струк-

туры микробных клеток

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашен.

Методика окраски по Граму:

1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый+йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

2 этап. Обработка этанолом (дифференциация)

одни микробыдругие микробы

сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый

фиолетовый+йод, не обесцвечиваются фиолетовый+йод, обесцвечиваются. это связано с тем, что: объясняется тем, что:

-клеточная стенка толстая, -клеточная стенка микробов тонкая,

-в ее состав входит много пеп- -пептидогликана мало,

тидогликана,

-имеются тейхоевые кислоты - тейхоевых кислот нет

- по строению клеточная стенка - структура клеточной стенки

представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, поэтому

образование, поэтому после обра- после обработки этанолом поры

ботки этанолом поры клеточной остаются прежними, краска

стенки суживаются и краска не - вымывается, микробы обесцве-

вымывается. чиваются

3 этап. Окраска фуксином

одни микробыдругие микробы

остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,

грамположительные: грамотрицательные:

1.Все кокки за исключением 1.Гонококки и менингококки

гонококков и менингококков

2.Все спорообразующие палочки 2.Большинство неспорообразующих

палочек

3.Из неспорообразующих бактерий 3.Спириллы

туберкулезная и дифтерийная палочки

4.Актиномицеты 4.Риккетсии

5.Грибы 5.Микоплазмы

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 м дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Методика окраски по методу Циля- Нильсена:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин;

2. Снять бумагу, промыть мазок водой;

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания;

4. Промыть водой;

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течении 3-5 мин;

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Методика окраски по методу Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы- синий.